论文部分内容阅读
为大力推进畜牧业生产方式的转变,国家生猪规范化生产技术日渐成熟。然而,由于生猪饲养环境未能得到根本性的改善,导致猪传染性疾病对养猪业,甚至人类的健康危害日趋严重。诊断、治疗及防控的难度越来越大,对于新发现的病原以及多种病原体混合感染的诊断需求尤为迫切。仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS),是近些年我国多地区猪场发生的一种慢性、进行性的疾病,其病因较为复杂,致死率极高,主要为猪圆环病毒感染。最近研究发现,PMWS存在猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)与其他病原的混合感染。自发现PMWS以来,围绕着PMWS病原的研究不断深入。PCV与PMWS高度相关,PMWS病猪的病变组织中均发现大量的PCV2抗原,借助于细胞培养技术分离出PCV2病毒,但没有分离到其它病原。而在PMWS现场的病例中发现,其临床表现特定病变与PCV2严重程度一致。PMWS病例中经常检出PCV2而较少检出其它病原的结果,表明PCV2是PMWS的主要病原,单独感染能够引起PMWS。细环病毒(Transfusion Transmitted Virus或Torque teno virus,TTV),为指环病毒科(Anelloviridae)细项环病毒属成员(Anellovirus),是一种无囊膜DNA病毒,基因组呈单链、闭合环状。猪细环病毒(Torque Teno Sus,TTSuVs)能够感染很多外表健康的动物。TTSuVs病毒本身的感染不会立刻引发疾病。但是TTSuVs可以影响一些疾病的发生和发展,甚至影响它们的结果。目前还没有报道TTSuVs直接与猪某些疾病的发生有关。由于PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,而PCV2的遗传关系与TTSuVs最为接近,有学者认为PMWS等由猪圆环病毒引起的相关疾病(PCVD)可能是PCV2与TTSuV协同感染引起的。为此本研究构建PCV2与TTSuV2双重荧光定量PCR检测方法,为在临床上能够同时快速、准确检测PCV2与TTSuV2提供方案,为分析PCV2与TTSuV2的协同致病性提供途径。1.PCV2型实时荧光定量PCR检测方法的建立提取病料中病毒基因组,根据GenBank公布的PCV2序列保守区设计特异性引物进行PCR扩增。将PCR产物纯化后与克隆载体连接,构建标准质粒。以标准质粒为模板,进行引物浓度、退火温度、Taq酶用量的优化,绘制实时荧光定量PCR的标准曲线,建立PCV2实时荧光定量PCR检测方法。PCV2单重荧光定量PCR最佳反应体系为:Premix Ex Taq(2×)12.5μL,引物1.0μM,探针0.75μM,DNA模板3μL,水补至20μL。优化后反应条件为:95℃,30 s;95℃,10s;56.6℃,30 s;35个循环。2.TTSuV2型实时荧光定量PCR检测方法的建立提取病料中病毒基因组,根据GenBank公布的TTSuV2序列保守区设计特异性引物进行PCR扩增。将PCR产物纯化后与克隆载体连接,构建标准质粒。以标准质粒为模板,进行引物浓度、退火温度、Taq酶用量的优化,绘制实时荧光定量PCR的标准曲线,建立TTSuV2型实时荧光定量PCR检测方法。TTSuV2单重荧光定量PCR最佳反应体系为:Premix Ex Taq(2×)12.5μL,引物1.0μM,探针1.0μM,DNA模板3μL,水补至20μL。优化后反应条件为:95℃,30 s;95℃,10 s;55.6℃,30 s;35个循环。3.PCV2型与TTSuV2型双重荧光定量PCR检测方法的初步应用通过DNASTAR软件分析,确认两个探针,四个引物相互之间不会形成引物二聚体,寻找最佳的退火温度和引物及探针浓度。结果显示,TTSuV2及PCV2双重荧光定量PCR的最佳条件如下:引物浓度分别为PCV2 1.0μM、TTSuV2 1.0μM;探针浓度分别为PCV2 1.0μM、TTSuV2 1.0μM;反应条件为95℃、30 s,95℃、10 s,55.8℃、30 s,35个循环。在此条件下双重荧光定量PCR对两种标准品的最低拷贝数均为1×10~2 copies/μL,不存在非特异性扩增曲线,无交叉反。应用所建立的双重荧光定量PCR检测方法,对2017-2018年8月期间,送检至吉林农业科技学院猪生态养殖及疫病防控中心的300份血清样本进行检测,结果显示PCV2单独感染率检出率为36.0%,TTSuV2单独感染检出率为60.0%,两种病毒混合感染检出率为14.8%。本研究建立的2型猪细环病毒及2猪圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法比普通PCR方法更敏感、特异,且具有较好的临床实用性,可用于临床样品的检测。