第一部分miR-320、PBX3在胶质瘤组织中的表达目的胶质瘤是最常见的脑部肿瘤,它们具有形态多样性、基因复杂性和向周围正常脑实质扩散特征。这些特征使得目前很多治疗措施都无效,患者具有较高的死亡率。尽管目前在治疗方法上有了很大的改进,但是仍然改变不了胶质瘤预后差的问题。故寻找有效的治疗措施和预后预测的生物标记物是临床上亟待解决的问题,但解决此问题的关键是要明确胶质瘤发生发展的机制。MicroRNA(miRNA)是一类短的、内源性的和非编码的RNA分子,与目标mRNA分子3’-非翻译区互补结合,参与基因的转录和转录后翻译。研究表明miRNA可调控与细胞增殖和凋亡相关的基因表达。miRNA在肿瘤生物学行为中起着至关重要的作用。因此,miRNA已被确立为新的、必不可少的癌基因和抑癌基因。以往研究表明,miR-320参与多种肿瘤的发生发展。例如miR-320被证明在抑制肿瘤血管生成方面发挥着关键作用,其机制是通过抑制Neuropilin 1表达来抑制肿瘤血管生成,因此miR-320可能具有潜在的抗血管生成的作用。此外,miR-320已被发现在乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、大肠腺瘤和粘膜下浸润性癌组织中具有抑制细胞增生和诱导细胞凋亡的作用。然而,到目前为止,miRNA-320参与胶质瘤发生发展的分子机制尚不清楚。前B细胞白血病同源盒基因(PBX)是一类转录因子,在肿瘤的生长中发挥重要的作用。他通常通过与其他同源蛋白例如HOX相互作用,与特异的DNA序列结合,从而导致靶基因转录激活或抑制。PBX表达的增加与卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等恶性肿瘤的进展密切相关。PBX/HOX相互作用干扰可诱导细胞凋亡,抑制卵巢癌、肾癌、非小细胞肺癌和乳腺癌的生长。因此,PBX家族可能与肿瘤细胞的恶性行为密切相关,并可成为肿瘤治疗的靶分子。PBX3,是人类PBX家族的一员,一直被报道与肿瘤发生发展有关。据报道PBX3在前列腺癌组织中表达升高。在2013发现,PBX3在白血病发生发展中是HOXA9的重要辅助因子直接靶向调控HOXA/PBX3可抑制白血病细胞增生和使细胞对标准化疗敏感。最近研究报道PBX3在胃癌中表达上调并且调控胃癌细胞的增生。综上所述,PBX3作为白血病和实体癌中的癌基因,是调控细胞恶性生物学行为的重要因素。MAPK信号通路在许多生物学行为中起着关键作用,包括细胞增殖、肿瘤侵袭、干细胞样表型和对化疗的抵抗。有研究表明PBX3可通过激活MAPK信号通路促进癌细胞的转移和侵袭。尽管一些研究证实PBX3与各种癌症密切相关,但很少有研究证实PBX3与胶质瘤有关。为明确miR-320和PBX3与胶质瘤发生发展的关系,并初步分析miR-320在胶质瘤中对PBX3是否有调控作用,本文拟从以下两个方面进行研究:(一)miR-320在胶质瘤组织中的表达情况:通过实时定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-320在胶质瘤组织和癌旁组织中的表达发现,miR-320在胶质瘤组织中表达水平明显低于癌旁组织。(二)PBX3在胶质瘤组中的表达情况:通过实时定量PCR(qRT-PCR)法检测PBX3在胶质瘤组织和癌旁组织中的表达发现,PBX3在胶质瘤组织中mRNA表达水平明显高于癌旁组织。进一步通过Western blot检测发现PBX3在胶质瘤组织中的蛋白表达水平明显高于癌旁组织。方法一、通过实时定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-320在胶质瘤组织中和癌旁组织的表达情况。二、通过实时定量PCR(qRT-PCR)法检测PBX3在胶质瘤组织和癌旁组织中表达情况,Western blot法检测PBX3在胶质瘤组织和癌旁组织中蛋白表达情况。三、统计分析:所有实验至少进行三次,所有样本都进行了三次分析,我们用SPSS12.0统计软件对数据进行t检验,方差分析,P<0.05,差异在统计学上才有意义。结果一、miR-320在胶质瘤组织中的表达水平明显低于癌旁组织。二、PBX3在胶质瘤组织中mRNA的表达水平明显高于癌旁组织,在胶质瘤组织中的蛋白表达水平明显高于癌旁组织。结论一、miR-320在胶质瘤组织中的表达水平明显低于癌旁组织,说明miR-320可能在胶质瘤中具有抑癌基因的作用。提示miR-320可能抑制胶质瘤的发生发展。二、PBX3在胶质瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织,说明PBX3在胶质瘤中可能具有促癌作用,提示PBX3可能促进胶质瘤的发生发展。三、miR-320在胶质瘤中低表达,则PBX3高表达,在胶质瘤中表达水平呈负相关,说明在胶质瘤中miR-320对PBX3可能具有调控作用。第二部分miR-320在胶质瘤中靶向调控PBX3的表达目的miRNA具有在转录水平上调控基因表达的作用,其长度为18～25个核苷酸,被称为非编码RNA。该调控是通过将miRNA与其靶向mRNA的3’UTR结合,从而导致mRNA链的降解。miRNA与靶分子之间有两种互补程度,完全互补会导致RISC内降解,而不完全互补会抑制mRNA转录,接着会导致靶分子不稳定而降解。由于即使在不完全配对的情况下也可以调控转录,因而单个miRNA可以调控多个mRNA,同时单个mRNA可以被多个miRNA当作靶分子。miR-320作为miRNA家族一员,与许多肿瘤的发生发展有关,在一些肿瘤中具有抑癌基因的作用,一些研究发现其在结直肠癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌和人视网膜母细胞瘤中表达下降。miR-320具有调控肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞侵袭及转移、肿瘤细胞凋亡和化疗耐药的生物学功能。PBX3是PBX转录因子家族一员,且PBX3在肿瘤发生发展中具有重要作用。PBX3在胃癌、结直肠癌、前列腺癌和白血病中表达上调,说明PBX3具有促癌作用。PBX3在不同肿瘤中受到其他miRNA调控,如miR-33a-3p、miR-495和miR-497。最近研究发现在多发性骨髓瘤中miR-320对PBX3具有调控作用。本研究首先用在线工具预测PBX3为miR-320的潜在靶分子,然后通过转染miR-320 mimics验证miR-320对靶分子PBX3的调控作用,最后通过荧光素酶报告实验验证miR-320与PBX3 3’UTR直接结合。方法一、细胞培养.· U87和U251细胞株购自中国科学院细胞库,细胞在加入10%小牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)中培养,细胞被培养和保持在37℃,5%CO2湿润培养箱中。二、细胞转染:将miR-320 mimics和NC(阴性RNA对照)转入U87和U251胶质瘤细胞株。三、实时荧光定量PCR检测转染miR-320 mimics和NC后miR-320和PBX3表达。四、Western blot检测转染miRNA-320 mimics和NC后PBX3在蛋白水平表达。五、荧光素酶报告实验1通过Targetscan在线工具预测miR-320 靶分子。2扩增PBX3的3’-UTR,并将其克隆到pmirReport载体中荧光素酶编码区下游形成PBX3野生型载体。利用突变位点定向突变试剂盒将突变点插入到潜在的miR-320结合位点中形成突变型载体。将含有PBX3 3’-UTR野生型和突变型的荧光素酶报告基因质粒,还有miR-320 mimics共转染U87和U251胶质瘤细胞株,转染36小时后,收集细胞,用荧光素酶双报告实验检测荧光素酶活性。六、统计分析:所有实验至少进行三次,所有样本都进行了三次分析,用SPSS12.0统计学分析软件,进行t检验和方差分析,P<0.05差异具有统计学意义。结果一、通过Targetscan在线预测工具,根据序列互补配对原则,我们发现PBX3基因3’-UTR有序列片段可能与miR-320互补结合。二、实时荧光定量PCR检测转染miR-320 mimics和NC后U87和U251胶质瘤细胞内miR-320表达情况发现,转染miR-320 mimics后miR-320在U87和U251胶质瘤细胞内表达水平明显高于NC组;同时,转染了miR-320 mimics的U87和U251胶质瘤细胞内PBX3 mRNA表达水平明显低于NC组。由此可见miR-320可抑制PBX3的表达。三、Western blot检测转染miRNA-320 mimics和NC后U87和U251胶质瘤细胞内PBX3在蛋白水平表达,发现转染了 miR-320 mimics的U87和U251胶质瘤细胞内PBX3蛋白表达水平明显低于NC组,与PBX3在mRNA水平一致,进一步证实miR-320对PBX3的表达抑制作用。四、将含有PBX3 3’-UTR野生型和突变型的荧光素酶报告基因质粒,还有miR-320 mimics共转染U87和U251胶质瘤细胞,并用荧光素酶双报告实验检测荧光素酶活性。miR-320过表达的胶质瘤细胞内荧光素酶活性显著降低,当针对miR-320结合位点突变时miR-320过表达的胶质瘤细胞内荧光素酶活性降低不显著。这说明miR-320可通过直接与PBX3 3’-UTR结合调控PBX3的表达。结论一、通过Targetscan在线预测工具,根据序列互补配对原则,我们发现PBX3基因3’-UTR有序列片段可能与miR-320互补结合。二、在胶质瘤中miR-320对PBX3具有调控作用。三、miR-320可通过直接与PBX3 3’-UTR结合调控PBX3的表达。第三部分miR-320对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响目的胶质瘤是神经系统肿瘤中最多见的肿瘤,一般认为起源于神经胶质细胞,有侵及周边脑组织的趋势。肿瘤多成浸润性生长,手术不易全切,治疗效果差。已知胶质瘤发生发展根本原因是无限增殖和凋亡抑制,对细胞增殖及凋亡调控紊乱的不断深入研究为进一步深入探讨胶质瘤发病的分子机制提供了重要启示。miRNA是内源性表达的小片段非编码RNA,在基因表达过程中起转录后调控的作用。越来越多的研究表明,miRNA涉及胶质瘤发病的核心信号传导,并可作为潜在生物标志物及治疗靶点。miR-320作为miRNA家族一员,在多种肿瘤中表达下调,如乳腺癌、间皮瘤、肝癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、口腔癌和宫颈癌。因此,miR-320在肿瘤的发生发展中具有重要作用。MAPK信号通路是细胞内重要的信号转导通路,可将细胞外的信号转导至细胞内并参与细胞增生、凋亡、分化和转化等生物学行为;磷酸化激活的MAPK激酶可一次磷酸化激活MAPK或ERK,激活的ERK可以转位进入细胞核激活一些转录因子,促进细胞周期进展和诱导抗凋亡基因转录,该信号通路异常导致细胞转化和抵抗凋亡,因此该通路是胶质瘤具有吸引力的靶点。研究发现该信号通路与肿瘤的发生发展密切相关。以往研究表明PBX3可以通过激活MAPK信号途径来促进大肠癌细胞的生长。因此,我们推测PBX3也可能通过激活MAPK信号通路来促进胶质瘤的发生发展。为明确miR-320对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响,为miR-320临床应用提供理论和实验基础,本论文拟从以下三个方面进行研究:(一)miR-320对胶质瘤细胞增殖的影响研究:通过MTT和克隆形成实验证实转染了 miR-320mimics的胶质瘤细胞增殖能力明显降低。同时,进一步通过流式细胞术分析细胞周期分布发现,转染了 miR-320 mimics的胶质瘤细胞G0/G1期细胞比例明显增加。(二)miR-320诱导胶质瘤细胞凋亡机制的研究:用流式细胞术检测发现,miR-320 mimics组胶质瘤细胞的凋亡率明显高于NC组,凋亡细胞明显增多。同时miR-320 mimics组胶质瘤细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase 3表达水平明显高于NC组。(三)miR-320过表达或PBX3低表达抑制胶质瘤细胞MAPK通路的激活:Western blot检测发现miR-320 mimics组RAF-1、p38、ERK1/2、ERK5 和JNK酸化水平与NC组相比明显降低;同样shPBX3组RAF-1、p38和ERK1/2磷酸化水平与NC组相比也明显降低。方法一、细胞培养:U87和U251胶质瘤细胞株购自中国科学院细胞库,细胞在加入1 0%小牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)中培养,细胞被培养和保持在37℃,5%CO2湿润培养箱中。二、细胞增殖检测:MTT法检测转染了 miR-320 mimics和NC的U87和U251胶质瘤细胞的增殖情况,克隆形成实验检测转染miR-320 mimics和NC组U87和U251胶质瘤细胞克隆形成能力。三、细胞周期检测:流式细胞术检测转染了 miR-320 mimics和NC质粒的U87和U251胶质瘤细胞的细胞周期的分布。四、细胞凋亡检测:流式细胞术检测转染了 miR-320 mimics和NC后,U87和U251胶质瘤细胞凋亡情况。五、Western blot法检测蛋白表达:Western blot法检测miR-320 mimics组和NC组凋亡蛋白Caspase 3和Cleaved Caspase 3表达;Western blot法检测miR-320 mimics组和NC组MAPK信号通路分子p-Raf-1、Raf-1、p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-ERK5、ERK5、p-JNK和JNK蛋白表达;Western blot法检测shPBX3 组和NC组p-Raf-1、Raf-1、p-p38、p38、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表达。六、统计分析:所有实验至少进行三次,所有样本都进行了三次分析,采用SPSS12.0软件进行t检验和方差分析,P<0.05差异具有统计学意义。结果一、通过MTT检测发现转染了miR-320 mimics的胶质瘤细胞增殖明显降低。克隆形成实验也显示,转染miR-320 mimics的胶质瘤细胞克隆形成数目明显低于NC组。为进一步研究胶质瘤细胞增殖与细胞周期的变化的关系,通过流式细胞术检测发现转染了miR-320 mimics的胶质瘤细胞G0/G1期细胞数明显增加。二、通过流式细胞术检测发现,miR-320 mimics组U87和U251胶质瘤细胞的凋亡率明显高于NC组,凋亡细胞明显增多。此外,转染miR-320 mimics可使Cleaved Caspase 3表达升高。三.通过western blot检测发现U87和U251胶质瘤细胞中,miR-320 mimics组Raf-1、p38、ERK1/2、ERK5和JNK磷酸化水平明显低于NC组。为明确miR-320是否通过靶向调控PBX3表达发挥作用,使用shPBX3抑制PBX3基因的表达,在U87和U251胶质瘤细胞中,PBX3基因表达被抑制后Raf-1、p38和ERK1/2磷酸化水平明显降低。结果表明,miR-320可能通过靶向调控PBX3来调控MAPK信号通路来抑制胶质瘤细胞的增殖。结论一、miR-320通过调控细胞周期分布来抑制胶质瘤细胞增殖。二、miR-320具有诱导胶质瘤细胞凋亡的作用。三、miR-320通过调控PBX3表达来调控MAPK信号通路来抑制胶质瘤细胞增殖。