新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种高度接触性的烈性传染病。禽类感染后以呼吸道、消化道和中枢神经系统损伤为主要特征。该病呈世界性分布,给养禽业造成了巨大的经济损失。核酸适配体是利用SELEX技术筛选与靶物质特异性结合的单链DNA或RNA片段,有“化学抗体”之称。由于具有免疫原性低、靶分子范围广、分子质量小、易于化学合成和改造标记等优点,核酸适配体在疾病诊断和治疗领域中显现出重要的应用价值。本研究,体外合成总长度为81 nt的ssDNA文库,中间为40 nt的随机序列,两端为用于PCR扩增的固定序列。通过优化PCR条件制备高纯度的dsDNA和ssDNA,实验确定PCR最佳退火温度Tm=65°C,反应循环数为12个循环,不对称PCR引物含量比为F:R=100:1,下游引物含量固定为0.5 pmoL,反应循环数为40个循环。筛选以原核表达的HN蛋白和新城疫病毒GM株为靶标,利用硝酸纤维素膜过滤方法和微孔板法分离靶标-寡核苷酸复合物,经过10轮的反复筛选,获得针对HN蛋白和新城疫病毒GM株的富集文库。最后一轮筛选得到的ssDNA文库经PCR扩增为双链后,进行连接、转化并克隆测序。通过ELISA实验挑选出亲和力和特异性高的适配体,使用DNAMAN软件对测序结果进行一级结构分析,随机序列区(N40)的相似性为61.5%~98.4%,均富含C或T,无保守序列,并利用Mfold预测其二级结构,主要形成大环加小环突起的结构。ELISA和Dot blot实验分析适配体的亲和力和特异性,实验结果显示适配体B53对HN蛋白及新城疫病毒GM株有较高的亲和力,并且能够特异性识别HN蛋白和新城疫病毒GM株,而对禽流感病毒、传染性法氏囊病毒和SPF尿囊液无反应性。适配体血凝抑制试验结果表明,针对GM株病毒的优势适配体均具有不同程度的的血凝抑制活性,病毒对照组血凝效价为11log2,A1处理组的血凝效价为9log2,A3处理组的血凝效价为7log2,A20处理组的血凝效价为10log2,B7、B53和B60处理组的血凝效价为8log2。噬斑试验结果表明,适配体B53具有病毒噬斑抑制能力,能够减少44.2%的GM株病毒噬斑。综上,本研究利用SELEX技术筛选获得的核酸适配体,能够特异性识别新城疫病毒,具有血凝抑制活性和较强的病毒噬斑抑制能力,为NDV诊断及其抗病毒研究奠定一定基础。