【摘 要】
：
CD163是SRCR蛋白超家族的一员,为典型的Ⅰ型糖基化膜蛋白,因富含半胱氨酸,内部可以形成的9个由二硫键连接的构成的结构域。研究表明CD163与PRRSV感染密切相关,其作为PRRSV的
论文部分内容阅读
CD163是SRCR蛋白超家族的一员,为典型的Ⅰ型糖基化膜蛋白,因富含半胱氨酸,内部可以形成的9个由二硫键连接的构成的结构域。研究表明CD163与PRRSV感染密切相关,其作为PRRSV的受体介导病毒的脱衣壳和病毒核酸在细胞质内的释放。猪肺泡巨噬细胞(PAM)为PRRSV的靶细胞,目前通过SV40Large T抗原转染原代PAM细胞构建了3个传代细胞系,但均不支持PRRSV感染,检测发现细胞系无CD163表达。本研究旨在通过含CD163基因的重组真核表达质粒转染传代PAM细胞系,使其表达CD163,以期获得能够支持PRRSV感染的细胞系。1.CD163基因全长克隆获得及重组真核表达载体构建与鉴定根据GenBank上发表的猪CD163基因序列设计并合成了扩增猪CD163开放阅读框序列的特异性引物。由实验室保存原代猪肺泡巨噬细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出3348bp的目的片段,并将其克隆到pMD19-T载体,经PCR,酶切和测序证明为猪CD163序列。鉴于扩增过程中CD163cDNA中有5个位点的碱基突变引起相应的氨基酸的改变,使用TaKaRa公司的点突变试剂盒将所涉及的碱基加以突变修饰。将基因片段克隆到真核表达质粒pcDNA4.0和pIRES载体上,通过酶切鉴定确定重组真核表达质粒构建成功。2.猪CD163的PRRSV受体的功能本实验旨在通过重组真核表达质粒pIRES-CD163瞬时转染PRRSV的非敏感细胞系BHK-21和PK-15,利用RT-PCR方法和间接免疫荧光技术检测CD163在细胞上的表达,然后进行病毒增殖试验,对比转染CD163前后细胞对PRRSV敏感性的变化。以验证猪CD163作为PRRSV受体,仅表达CD163就能够使得非敏感细胞系对PRRSV敏感的论断。瞬时转染pIRES-CD163后的BHK-21和PK-15细胞中均表达了CD163,并且这些转染后的细胞能够增殖PRRSV并产生子代病毒。3.稳定表达CD163的PAM细胞系的建立本实验旨在使用重组真核表达质粒pcDNA4.0-CD163瞬时转染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21(CRL-2843),经RT-PCR方法和间接免疫荧光技术确定CD163在细胞上的表达后,添加zeocin进行抗性筛选,采用有限稀释法,经过3轮筛选获得8株阳性克隆,分别命名为3G10-C2,3G10-D2,3G10-F2,3G10-B3,3G10-D4,3G10-B6,3G10-A8,3G10-H8。该8个阳性克隆阳性率均在90%以上。使用RT-PCR、间接免疫荧光技术检测确定重组PAM细胞系构建成功。重组PAM细胞系进行PRRSV增殖实验,确定转染CD163后细胞对PRRSV增殖能力。去除抗生素后连续传代10代,间接免疫荧光检测确定重组细胞株在10代内性状稳定。本实验稳定表达猪CD163的PAM重组细胞系,主要目的在于利用该重组细胞系体外繁殖PRRSV,并且使用重组PAM细胞株进行中和抗体实验,对不同的PRRSV疫苗进行质量评价
其他文献
随着采矿工业的迅速发展,矿井开采深度不断加大,采掘机械化程度日益提高,井下地热和机械热显著增加,也有的矿井受各种热源影响,高温矿井相继增多,矿井热害日趋严重,劳动环境
文章是社会生活的反映，是时代的一面镜子。如果远离社会，把握不住时代脉搏，就写不出震撼人心的艺术作品。因此，在作文教学中教师必须时刻关注国内外发生的重大事件，及时让学生了解其来龙去脉，逐步培养他们了解社会、关心社会的良好习惯，并积极对其进行评价，畅谈自己的见解，这样既有利于培养学生关心社会的主人翁精神，又能锻炼他们的写作能力。我根据近半年来的研究，摸索出一些指导学生写作的经验，供同行参考。 一、选
对语文教师来说，作文教学是一个难题。为充分发挥学生的主体能动作用，我主张作文教学应分为“写前指导、写后评讲、评后自改”三个基本环节，这对于提高学生的写作能力大有裨益。 一、写前指导 写前指导是作文教学的必要环节。一次作文训练要真正起到训练的作用，让学生的写作能力有明显的提高，教师必须首先做好写前指导工作。 1.明确目标。所谓明确目标，就是确定本次作文训练的任务、目的和要求。目标的确定主要有两
许多学生总觉得写作文是件让人头疼的事，拿起笔就磕磕绊绊，像挤一盒快要完的牙膏，半天都挤不出一小点，实在令人难受。平时作文也罢，当场作文就更是捉襟见肘了。其实，作文并不可怕，只要我们精心准备，掌握方法要领，当场作文就会迎刃而解。 一、勤于积累能反映新时代特征的新材料 当今社会日新月异，每天都会发生不少能反映社会真、善、美与假、丑、恶的新材料，这些新人物、新事件和新观点为丰富学生思想、提供最佳写作
一、学生人文精神的缺失 《易经》说：“文明于止，人文也。”“人文”是人类文明的成果，其作用是“教化天下”。作家王蒙也曾谈道：“人文精神是一种以人为主体，以人为对象的思想，或简单地说，人文精神我们姑且可以定为一种对人的关注。”今天不少的学生对父母关爱，心无感激，认为理所应当。面对理想，有一个学生更直率：我从来不去想以后的事，船到桥头自然直，反正我老爸有钱，还怕饿死不成？甚至缺乏起码的责任和美德。因
作文教学是语文教学必不可少的组成部分，但写作文，对于小学生来说，如果引导欠佳，极容易使他们产生畏惧、厌烦情绪。如何让学生写作不头痛，把自己的所看所思所感所悟都完全地表达出来，这是语文教师应着力解决的问题。我认为，教师应从多方面入手，消除学生的畏难情绪，激发学生的写作兴趣，注重读写结合，提高学生的写作能力。 一、从观察入手，培养学生的观察习惯，丰富学生的写作素材。 学生在日常生活中，对身边的人、
曾几何时,由听众点播歌曲开始,热线电话在广播电台的节目中初试锋芒,时隔不久,热线电话已在广播中热气腾腾地发展起来了。现在广播节目中的热线电话可谓内容品类纷繁,形式多
三年级学生刚刚学写整段作文，不懂写作方法，缺乏写作素材，因此，三年级的作文指导尤为重要。小学语文老师应该高度重视培养学生的写作兴趣，提高学生的写作水平，为学生引好路。 一、要有兴趣，以培养兴趣为主。 1.应顺应儿童天性，我手写我口，我手写我心。第一学段的小学生，他们喜欢把一天中自己家里发生的事或同学间发生的事不分重点地讲一遍，没有听众时，他们还会自言自语。根据这一特点，我让孩子们把和老师想说的
伪狂犬病(Pesudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pesudorabies Viurs，PRV)所引起的一种急生烈性传染病，又称奥叶兹基氏病(Aujeszkyps Disease，AD)。属于高度致死性疾病，主要症状包括奇
蜱是一类具有顽强生命力并对环境适应性强的体表寄生虫。是世界第二大生物传播媒介，能够传播多种疾病，可感染动物和人类。在世界范围内广泛存在，对人类自身健康、动物养殖业和自