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第一部分Insig-1稳定表达细胞株的建立及过表达Insig-1在p细胞糖脂毒性保护作用的研究第一章pcDNA3.1(+)-Insig-1重组表达质粒的构建及Insig-1稳定表达细胞株的建立目的：为探讨过表达Insig-1对保护p细胞糖脂毒性的作用,构建pcDNA3.1(+)-Insig-1重组表达质粒并建立稳定表达Insig-1的INS-1细胞株。方法：采用RT-PCR法从3T3-L1细胞获取小鼠Insig-1基因翻译区序列,并克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,PCR.酶切及测序鉴定后,经脂质体转染入INS-1细胞并利用G418筛选阳性细胞株。通过RT-PCR.Western blot法检测Insig-1mRNA和蛋白在未转染组、pcDNA3.1(+)-Insig-1转染组细胞中的表达。结果：①从3T3-L1细胞中扩增出Insig-1基因翻译区序列,并成功插入pUCm-T载体中；②HindⅢ和EcoR Ⅰ双酶切pUCm-T-Insig-1及pcDNA3.1(+)载体后,成功将小鼠Insig-1基因插入pcDNA3.1(+)中；③酶切、测序鉴定所插入片段的大小和基因序列准确无误,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Insig-1；④INS-1细胞转染pcDNA3.1(+)-Insig-1后,RT-PCR和Western blot法分析结果均显示,Insig-1mRNA及蛋白表达较未转染的INS-1细胞组均显著增加,提示pcDNA3.1(+)-Insig-1成功转染INS-1细胞并高效表达。结论：1.成功构建pcDNA3.1(+)-Insig-1重组表达质粒；2.建立了稳定表达Insig-1的INS-1细胞株。第二章过表达Insig-1对β细胞糖脂毒性的保护及其机制研究目的：探讨过表达Insig-1对高糖诱导的INS-1细胞糖脂毒性的保护作用及机制。方法：未转染组及pcDNA3.1(+)-Insig-1转染组的INS-1细胞均培养于正常糖(含11.2mmol/L葡萄糖)及高糖(含25.0mmol/L葡萄糖)的1640培养基Oh、24h及72h。油红“O”染色观察细胞内脂滴聚集及Elisa法检测培养液上清游离脂肪酸(FFA)的含量、MTT检测细胞活力、流式细胞仪检测各组细胞凋亡率、Western blot检测内质网应激凋亡IREla途径中相关蛋白(IRE1a, JNK,CHOP,BCL-2)的表达、real-time PCR检测胰岛素分泌相关基因(IRS-2,PDX-1,UCP-2,Insulin,GLU-2)及脂肪酸合成酶(FAS)的表达、放免法检测葡萄糖刺激的胰岛素释放。结果①高糖干预pcDNA3.1(+)-Insig-1转染组细胞培养液上清FFA含量及细胞内脂滴聚集均低于对照组(P<0.05)②两组细胞的细胞活力在正常糖培养0h、24h、72h及在高糖培养24h下并无明显差异(p>0.05),但高糖培养72h后,INS-1组细胞活力较INS-1-Insig-1组明显下降(p<0.05)；③两组细胞在正常糖培养下0、24、72h凋亡率无明显差异(p>0.05),但在高糖培养24及72h后,[NS-1-Insig-1组细胞凋亡率较INS-1组明显下降(24h：p<0.05,72h：p<0.01)；④p细胞凋亡内质网应激途径相关蛋白的表达均低于对照组(P<0.05)、胰岛素分泌量及胰岛素分泌相关基因均高于对照组(P<0.05)、而正常糖干预后两组内质网应激相关蛋白、葡萄糖刺激的胰岛素分泌、FFA的含量及细胞内脂质的聚集均无明显变化(p>0.05)。结论Insig-1可能通过抑制SREBP-1c的作用,减少葡萄糖诱导的FFA的合成,抑制内质网应激途径的相关蛋白的表达减少胰岛p细胞的凋亡,并上调胰岛素合成相关基因的表达等途径改善p细胞的糖脂毒性。第二部分水飞蓟宾对β细胞糖脂毒性保护的研究第一章水飞蓟宾改善β细胞糖脂毒性的作用目的：研究水飞蓟宾对高糖诱导的INS-1细胞糖脂毒性的保护作用。方法：将INS-1正常细胞组及水飞蓟宾干预组均培养于正常糖(含11.2mM葡萄糖)及高糖(含25.0mM葡萄糖)的1640培养基0、24及72h。油红“O”染色观察细胞内脂滴聚集及Elisa法检测培养液上清游离脂肪酸(FFA)的含量、MTT检测细胞活力、Hoeche33258染色及PI/Annexin V双染色检测各组细胞凋亡率、放射免疫法检测葡萄糖刺激的胰岛素释放。结果①水飞蓟宾显著抑制高糖诱导的INS-1细胞内脂质的合成；②水飞蓟宾并不影响正常糖浓度培养下的INS-1细胞活力,且与高糖或高糖+水飞蓟宾干预24h无明显差异(p>0.05),但水飞蓟宾却能改善高糖干预INS-172h的细胞活力(p<0.05)；③水飞蓟宾并不改善正常糖及高糖干预INS-1细胞24h的凋亡率(p>0.05),但能减少高糖干预72h后的凋亡率(p<0.05)；④水飞蓟宾并不能改善各组细胞的基础胰岛素分泌(p>0.05),但能显著改善高糖刺激的胰岛素分泌(p<0.05)。结论水飞蓟宾能够保护高糖诱导的p细胞糖脂毒性,减少p细胞凋亡、改善葡萄糖刺激的胰岛素分泌及抑制细胞内脂质的合成。第二章Insig/SREBP-lc途经在水飞蓟宾改善β细胞糖脂毒性中的机制研究目的：探讨Insig/SREBP-1c途径在水飞蓟宾对INS-1细胞糖脂毒性的作用。方法：①将INS-1正常细胞组及水飞蓟宾干预组均培养于正常糖(含11.2mM葡萄糖)及高糖(含25.0mM葡萄糖)的1640培养基0、24及72h。Western blot检测Insig-1,2、SREBP-1c及BCL-2蛋白的表达、real-time PCR检测Ⅰnsig-1,2、 SREBP-1c、FAS及胰岛素分泌相关基因(IRS-2,PDX-1,UCP-2,Insulin)的表达；②将Insig-1干扰后,观察水飞蓟宾对干扰后INS-1细胞培养在正常糖及高糖环境下的细胞凋亡、Insig-1,2、SREBP-1c及BCL-2蛋白的表达。结果①Western blot及real-time PCR结果均显示水飞蓟宾并不影响正常糖浓度培养中Insig-1,2、BCL-2及SREBP-1c蛋白及mRNA的表达(p>0.05),但能显著上调高糖培养下的Insig-1,2、BCL-2及下调SREBP-1c (p<0.05)；②水飞蓟宾干预对正常糖浓度培养0、24、72h后IRS-2、PDX-1、UCP-2及Insulin mRNA的表达并无明显影响(p>0.05),但能上调高糖诱导的PDX-1. UCP-2、Insulin mRNA及下调IRS-1的表达(p<0.05)；③水飞蓟宾上调Insig-1干扰后的Insig-1,2、BCL-2及下调SREBP-1c蛋白的表达并减少Insig-1干扰后高糖诱导糖脂毒性的INS-1凋亡(p<0.05)结论水飞蓟宾能够改善高糖诱导INS-1细胞的糖脂毒性,其机制可能是通过上调Insig-1,2后抑制了SREBP-1c的转录并减少胰岛素分泌相关基因及脂质合成基因的表达。