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研究背景：多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种单克隆浆细胞异常增生的恶性肿瘤,可引起骨病变、肾功能受损、贫血等临床症状和多器官功能障碍,其发病率已居血液系统恶性肿瘤第二位。MM在我国的发病率呈逐年上升趋势,严重威胁国民的生活和健康。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,Bor)是目前治疗MM的最有效药物之一,以其为基础的化疗方案治疗MM患者总体有效率高达80-90%,但原发及继发性耐药是Bor治疗MM失败的主要原因,严重影响Bor的疗效。因此进一步探究MM耐药机制,寻找克服Bor耐药的方法,是临床上亟待解决的关键问题。泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质降解的主要方式,这种蛋白质降解途径在时间和空间上精确调控胞内各种蛋白质含量,其中E3泛素连接酶决定蛋白质降解的特异性。近年来,越来越多的证据表明,泛素-蛋白酶体途径相关组分的异常,特别是决定泛素-蛋白酶体系统降解蛋白特异性的E3连接酶的异常,和肿瘤发生、发展、转移及药物耐药密切相关,在维持MM细胞生长生存中亦发挥关键性作用。因此,深入研究E3连接酶在MM发生发展及耐药中的作用,对寻求临床治疗新靶点,判断预后有着重要意义。Pirh2是新发现的E3连接酶,最早被认为可协同双微体基因HDM2癌蛋白发挥调节p53的作用,受p53诱导激活并调控p53。近年随着研究的深入,能够和Pirh2相互作用的底物蛋白被逐渐发现,研究证实Pirh2与恶性肿瘤发生及预后相关,Pirh2可根据其底物特异性,既发挥促进肿瘤的作用,也可以抑制肿瘤发生,在不同类型肿瘤中发挥不同的作用。已有文献报道Pirh2参与浆细胞的增殖调控,而我们前期研究通过基因表达谱芯片发现Pirh2在MM Bor耐药细胞株中表达降低。值得关注的是究竟Pirh2在血液系统恶性肿瘤MM Bor耐药中是否发生作用,是否可作用于相关底物蛋白,从而介导Bor耐药及其具体机制仍未可知。遂本实验在此基础上,深入研究E3连接酶Pirh2在MM Bor耐药中的作用及其机制。研究目的：1.明确MM中,Pirh2与Bor耐药的关系,同时构建Bor耐药细胞株模型进一步研究Pirh2在Bor耐药中的作用;2.构建Pirh2敲除及过表达的慢病毒载体转染MM细胞,探讨Pirh2对MM细胞生物学行为的影响,揭示Pirh2在MM中的角色,并研究其具体机制；3.探究MM细胞中可能与Pirh2相互作用的底物蛋白,从而介导Bor耐药。初步研究Pirh2在MM细胞中参与哪些蛋白的泛素化调控。研究方法：1.利用免疫荧光、Western blot、RT-PCR技术分别检测Pirh2在MM细胞株RPMI8226、ARP-1、ARK、MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中的表达情况,并比较Pirh2在新诊断和难治复发MM患者(骨髓CD138+细胞)中的表达差异；同时浓度递增法建立Bor耐药细胞株NCI-H929.BR,并在耐药株中观察Pirh2的表达变化；2.用慢病毒载体构建Pirh2敲除及过表达的MM细胞,利用CCK-8法、流式细胞分析术测定Pirh2敲除及过表达对骨髓瘤细胞增殖、周期及凋亡的影响。在此基础上加用Bor观察其疗效改变,Western blot进一步检测Pirh2敲除及过表达后相关蛋白的改变；3.免疫共沉淀Co-IP技术结合质谱分析寻找MM细胞中可能与Pirh2相互作用的底物蛋白；4.基因表达谱芯片筛选Bor耐药细胞和亲本细胞基因表达差异,同时对Pirh2敲除、Pirh2过表达及对照组细胞进行基因表达谱芯片筛查,结合Co-IP及质谱分析结果,探寻受Pirh2调控并在Bor耐药中发挥作用的关键因子；5.构建MM荷瘤小鼠模型,皮下注射Pirh2敲除、过表达及对照组MM细胞ARP-1-Pirh2,ARP-1-ctl,NCI-H929-kd、NCI-H929-ctl构建MM移植瘤NOD/SCID小鼠模型,在体内验证Pirh2对骨髓瘤细胞的作用。研究结果：1. Western blot、RT-PCR结果显示Pirh2在MM细胞株RPMI8226、ARP-1、ARK、 MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中均表达,其中在ARK、ARP-1和LP-1细胞株中相对低表达,免疫荧光结果显示Pirh2在上述MM细胞中以胞浆表达为主。RT-PCR检测结果显示Pirh2在原代MM细胞(患者骨髓CD138+细胞)中也存在表达,其中难治复发患者Pirh2表达低于新诊断未治疗的MM患者(p<0.05)：2.采用浓度递增法自骨髓瘤细胞系NCI-H929成功建立Bor耐药株NCI-H929.BR,持续刺激6个月,CCK-8法检测Bor对亲本NCI-H929和NCI-H929.BR24h的IC50,分别为17.62±1.92nmol/L和234.30±6.02nmol/L,耐药倍数为13.30(P<0.05)。生长曲线及流式细胞分析术结果显示NCI-H929亲本和NCI-H929.BR的生长曲线和细胞周期分布无显著性差异(P>0.05)；3. Western blot检测Bor耐药株NCI-H929.BR建立过程中Pirh2蛋白表达变化,结果提示在Bor的反复刺激下,随着耐药株建立的时间推移,Pirh2蛋白表达逐渐降低。在RPMI8226、RPMI8226.BR和OPM-2、OPM-2.BR细胞株中也得到同样结果；4.MM细胞未予Bor处理时,Pirh2敲除或者过表达对MM细胞的周期、增殖、凋亡影响不明显(P>0.05)；5.Pirh2敲除可降低MM细胞对Bor敏感性,且细胞G1期阻滞明显降低。流式细胞分析术结果显示RPMI8226-kd、RPMI8226-ctl G1期比例分别为39.03±3.20%vs52.84±2.89%。OPM-2-kd、OPM-2-ctl G1期比例分别为42.40±5.84%vs57.00±6.23%。NCI-H929-kd、NCI-H929-ctl G1期比例分别为23.37±2.12%vs42.91±1.89%,和对照组相比,Pirh2敲除后Bor诱导的细胞G1期阻滞明显降低(p<0.05)。CCK-8法检测细胞增殖结果显示敲除Pirh2后,Bor抑制细胞增殖能力减弱。AnnexinV凋亡分析显示与对照组相比,敲除Pirh2组Bor诱导细胞凋亡减低。RPMI8226-kd、RPMI8226-ctl凋亡率分别为47.90±1.63%vs55.60±2.86%;OPM-2-kd、OPM-2-ctl凋亡率分别为48.30±1.17%vs63.60±1.24%;NCI-H929-kd、NCI-H929-ctl凋亡率分别为20.28±0.98%vs38.37±1.34%,Pirh2敲除后Bor诱导的细胞凋亡明显减少(p<0.05)；6.Pirh2过表达可增加MM细胞对Bor敏感性,且细胞G1期阻滞明显增加。ARP-1-Pirh2、ARP-1-ctl G1期比例分别为51.56±3.91%vs40.88±2.09%。ARK-Pirh2、ARK-ctl G1期比例分别为49.10±4.32%vs31.90±3.98%。LP-1-Pirh2、LP-1-ctl G1期比例分别为58.90土4.06%vs32.40±2.76%,和对照组相比,Pirh2过表达后Bor诱导的细胞G1期阻滞明显增加(p<0.05)。CCK-8法检测细胞增殖结果显示Pirh2过表达后,Bor抑制细胞增殖能力增强。凋亡分析显示,加用Bor处理24h后,与对照组相比,Pirh2组Bor诱导细胞凋亡增加。ARP-1-Pirh2、ARP-1-ctl凋亡率分别为66.90±3.73%vs41.70±1.86%。ARK-Pirh2、ARK-ctl凋亡率分别为76.80±4.17%vs66.60±3.24%。LP-1-Pirh2、LP-1-ctl凋亡率分别为22.02±1.23%vs15.53±2.03%,和对照组相比,Pirh2过表达细胞Bor诱导细胞凋亡增加(p<0.05)。7. Western blot结果显示Pirh2敲除细胞株RPMI8226-kd、OPM-2-kd及NCI-H929-kd c-myc和p53表达水平增加,而Pirh2过表达细胞株ARP-1-Pirh2、ARK-Pirh2、 LP-1-Pirh2c-myc和p53表达水平降低。在Pirh2敲除或过表达的MM细胞中,HDAC1、Tip60、USP28等蛋白水平均无明显改变；8.小鼠荷瘤实验证实Pirh2对皮下成瘤能力无明显影响,但Pirh2敲除后肿瘤组织c-myc表达水平增加。而Pirh2过表达后肿瘤组织c-myc表达水平降低；9.免疫共沉淀结合质谱分析鉴定Pirh2相互作用蛋白,结果提示Pirh2可能与代谢相关的蛋白DLAT、PDHX、PDHA1、PDHB,E3连接酶TRIM21及核糖体蛋白RPL13、RPL10等相互作用,基因芯片结果显示其中TRIM21、RPL13在骨髓瘤Bor耐药细胞中表达明显降低,提示其在MM细胞中可能参与Bor敏感性的调控,但仍需进一步研究证实。结论：1.骨髓瘤细胞Pirh2低表达和Bor耐药相关,Pirh2在MM细胞株RPMI8226、ARP-1、 ARK、MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中普遍表达,其中在ARK、ARP-1和LP1细胞株中相对低表达；Pirh2在难治复发MM患者中表达低于新诊断未治疗患者,成功构建Bor耐药细胞株,并证实Pirh2在耐药株中表达下调；2.Pirh2敲除或过表达对MM细胞本身增殖及细胞周期无明显影响,Pirh2敲除细胞株RPMI8226-kd、OPM-2-kd及NCI-H929-kd对Bor敏感性降低,而Pirh2过表达细胞株ARP-1-Pirh2、APK-Pirh2、LP-1-Pirh2对Bor敏感性增强；3.Pirh2可通过c-myc、p53介导Bor诱导的细胞增殖、凋亡和周期调控,介导Bor耐药;4.免疫共沉淀结合质谱分析鉴定Pirh2相互作用蛋白,结果提示Pirh2可能与代谢相关的蛋白DLAT、PDHX、PDHA1、PDHB,E3连接酶TRIM21及核糖体蛋白RPL13、RPL10等相互作用,基因芯片结果显示其中TRIM21、RPL13在骨髓瘤Bor耐药细胞中表达明显降低,提示其在MM细胞中可能参与Bor敏感性的调控,但仍需进一步研究证实。