由微生物和植物产生的聚酮类化合物种类繁多,数目庞大,是一大类生物活性优良的天然产物,目前已经成为新药开发的重要来源。其特殊的化学结构和生物合成机制,为合理化修饰生物合成途径获得结构类似物以及建立天然产物类似物库奠定了遗传和生物化学基础。红霉素是临床上广泛使用的用于治疗革兰氏阳性细菌感染的大环内酯类抗生素。其致敏性低,成药性好等特点使得它在临床抗菌药物中占据了极其重要的地位,由于红霉素复杂的化学结构和在利用化学修饰进行结构改造上的局限性,基于生物合成途径改造的组合生物合成方法已经成为目前对红霉素进行结构改造获得新型红霉素衍生物最为有效的方法。本文以红霉素高产菌S.erythraea HL3168为研究对象,以通过AT置换向红霉素聚酮碳骨架中引入新型侧链为目的,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向该株红霉素高产菌中转入外源基因的可能性。最终建立了该高产菌稳定的遗传操作系统。并以此为基础利用CRISPR/Cas9技术介导的基因编辑构建得到了 eryAⅢ基因缺失的突变株。此外,通过对其基因文库的构建和后期筛选修复得到了包含有6-dEB生物合成基因簇的粘粒,并在该粘粒上添加了 AntEV350G以提高CCR的选择性,通过回补实验证实了该粘粒的完整性,在此基础上,将来源于聚酮化合物Splenocin(SPN)生物合成基因簇中具有宽泛底物选择性的SpnD-AT模块通过置换引入红霉素的生物合成途径中,结合AT与上下游两侧linker区域的相互作用,通过打靶构建了包含四种不同置换区域的粘粒:1)只置换AT结构域;2)置换上游linker区域(KS-AT linker)、AT 以及下游 linker 区域(ATPost-linker);3)置换上游 linker区域(KS-AT linker)和 AT;4)置换 AT 和下游 linker 区域(AT Post-linker)。将其导入eryAⅢ基因缺失的突变株构建四种置换突变株,通过后续喂养实验希望向红霉素结构中引入不同的活泼官能团或芳香环侧链,对红霉素碳骨架进行结构改造获得一系列具有活泼官能团的新型化合物。通过最终产生衍生物的效率来确定最佳的置换方式,并以此为基础建立科学的AT置换理论。天然抗霉素(Antimycin,ANT)是通过聚酮合酶和非核糖体肽聚酶的杂合体系合成的,具有显著的生物活性。在本课题组前期对抗霉素的研究中发现了首例来源于苯丙氨酸的芳香性延伸单元并阐明了其生物合成机制,本课题以抗霉素原始产生菌Streptomyces sp.NRRL 2288为研究对象,借助前期的工作基础,以进一步的发展其它氨基酸引入聚酮碳骨架中的新方法为目的,通过对其β-氧化途径的阻断构建了烯酯酰水合酶(fadB)缺失的突变株,在此基础上,通过喂养5-氯戊酸发现目的产物氯丙基取代的Antimycin类似物的产量有明显提高。进一步证实了在阻断了 β-氧化途径的体系中,5-氯戊酸形成α,β-不饱和的酰基辅酶A后无法在进行后续的降解,有利于被CCR蛋白识别转化成相应的延伸单元。同时还初步尝试了喂养赖氨酸,鸟氨酸,甲硫氨酸相应的氧化脱羧降解产物。这为后续构建Ligase和烯醇还原酶基因强化表达的重组菌株提供了基础,也为基于AntE的晶体结构对其催化活性进行优化,针对一些没有活性或活性欠佳的底物对AntE进行定向改造以获得催化活性提高的突变蛋白提供了指导。