豚鼠大脑缺血再灌注后听皮层IRE1、XBP-1的表达及血液中CRP、IgM的变化

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目的:本实验以大脑缺血再灌注后的豚鼠为研究对象,通过免疫组织化学的方法观察IRE1、XBP-1在其听皮层的阳性表达,并利用ELISA法检测血液中C-反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白M(IgM)的变化,从而研究内质网应激及血液免疫反应在大脑缺血再灌注后听皮层神经元凋亡中的作用。方法:1选取健康雄性红目豚鼠20只,确定双耳听性脑干反应(Auditorybrain stem response, ABR)听阈均在10分贝(声压级)(decibel Soundpressure level, dB SPL)以内;将其随机分为5组,分别为正常对照组、缺血15min组、再灌注6h组、再灌注24h组及再灌注7d组,每组各4只。后四组在相同条件下采用夹闭双侧颈总动脉的方法来建立脑缺血再灌注损伤模型术,对照组不予手术;缺血15min组术后马上行ABR测试,其余实验组待再灌注至对应的时间点后行ABR测试,确定双耳听力受到影响;每组豚鼠ABR测试完毕后,均进行心脏采血行ELISA法检测,断头取脑行免疫组化检测。2用ELISA法检测血液CRP、IgM的浓度。首先对豚鼠行腹腔注射麻醉,暴露胸腔行心脏灌注前用1ml注射器插入心脏进行采血,收集血液后使其充分凝固,置4℃过夜,离心分离血清,将血清装于灭菌瓶内,贮存于-70℃冰箱;待所有血清标本收集完成后,统一包被,设置标准品孔和样本孔,加入标准品和样本,每孔都加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤,再加入底物显色,用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。3用免疫组织化学的方法测定IRE1、XBP-1的表达。待心脏采血后再心脏灌注生理盐水,冲净全身血液;然后换4%多聚甲醛液继续灌注至全身上下僵硬,从项部断头,剥离顶骨,取出双侧大脑半球,浸泡于4%多聚甲醛液中24小时后脱水,透明,浸蜡,包埋,4℃冰箱保存;待所有蜡块全部收集完成后,统一切片,摊片,烤片,脱蜡,水化,修复,封闭,加一抗过夜;次日加二抗,辣根过氧化物酶(HRP),用二氨基联苯胺(DAB)充分显色后,复染,脱水,封片;最后在40×10倍的光镜视野下,用彩色图像处理软件对棕色颗粒阳性细胞进行计数。结果:1ABR测试结果:对照组为10.0±2.47dB SPL,缺血15min组为20±1.56dB SPL,缺血再灌注6h为30±2.03dB SPL,再灌注24h为30±1.67dB SPL,再灌注7d为15±1.14dB SPL,再灌注6h与24h组比较,无显著统计学差异(P>0.01),其余各两组间比较均有统计学差异(P<0.01)。2ELISA法检测结果:CRP(umol/ml)对照组为1198.96±50.81,缺血15min组为1270.70±34.76,再灌注6h组为1467.80±73.67,再灌注24h组为1352.83±175.71,再灌注7d组为1252.56±41.32。实验组两两之间均有统计学差异(P<0.01);IgM对照组为987.32±39.13,缺血组为1064.90±39.78,再灌注6h组为1118.03±57.75,再灌注24h组为1122.43±55.40,再灌注7d组为1010.70±55.95,再灌注6h与24h组比较,无显著差异(P>0.01),其余各两组间均有差异(P<0.01)。3HE染色显示,各实验组凋亡细胞数目不等,对照组为2.6±1.13,缺血组为14.1±2.71,再灌注6h组为24.9±2.20,再灌注24h组为19.3±1.46,再灌注7d组为9.4±1.17,实验组两两之间均有显著差异(P<0.01)。4免疫组化结果显示各组IRE1、XBP-1均有显色。 IRE1的阳性颗粒数在对照组为9.4±1.56,缺血组为25.6±1.58,再灌注6h组为60.3±1.57,再灌注24h组为42.2±2.13,再灌注7d组为18.3±1.59,实验组两两之间均有显著差异(P<0.01);XBP-1的阳性颗粒数在对照组为10.6±1.24,缺血组为24.2±1.52,再灌注6h组为61.4±1.7,再灌注24h组为41.1±2.38,再灌注7d组为18.9±1.59,实验组两两之间均有显著差异(P<0.01);5IRE1与细胞凋亡率的相关性分析及XBP-1与细胞凋亡率的相关性分析:IRE1与细胞凋亡率成正相关(r=0.947,P=0.000)。XBP-1与细胞凋亡率成正相关(r=0.933,P=0.000)。6CRP与IRE1,细胞凋亡率的相关性分析:CRP与IRE1成正相关(r=0.747,P=0.000)。CRP与细胞凋亡率成正相关(r=0.755,P=0.000)。7IgM与IRE1,细胞凋亡率的相关性分析:IgM与IRE1成正相关(r=0.695,P=0.000)。IgM与细胞凋亡率成正相关(r=0.765,P=0.000)。结论:1在脑缺血再灌注损伤中,听皮层组织中IRE1α、XBP-1蛋白表达增加,IRE1α,XBP-1与细胞凋亡率均呈正相关,提示内质网应激参与了脑缺血再灌注损伤神经元细胞凋亡的发生发展,IRE1α,XBP-1介导的信号转导通路是内质网应激导致脑缺血再灌注损伤神经元细胞凋亡的重要机制之一。2CRP, IgM浓度与IRE1α、细胞凋亡率成正相关,提示脑缺血导致的听觉受损有可能引起血液免疫学改变,内质网应激反应激发并加强了免疫炎性反应。
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