急性肺损伤(acute lung injury,ALI)以及其进展为更危重阶段的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由肺内部和/或肺外部的各种非心脏原因(如严重感染,创伤,休克,吸入有害气体,病理性产科,中毒等)引起的,以进行性呼吸困难和难治性低氧血症为特征的急性炎症反应综合征,可引起呼吸功能不全,甚至并发严重的呼吸衰竭。我们通常将ALI/ARDS的病因分为两大类:即直接肺损伤因素以及间接肺损伤因素。直接肺损伤因素主要包括:各类肺部感染、胸部或肺部外伤等。间接肺损伤因素主要包括:休克、脓毒血症、全身炎症反应综合征、弥漫性血管内凝血等。肺部失控的炎症反应和/或全身失控的炎症反应是ALI/ARDS的最主要的发病机制。参与ALI/ARDS炎症反应的细胞因子主要包括:白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-12(IL-12)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),它们亦被称为促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokines,PIC);参与炎症反应的细胞主要有:多形核白细胞(PMN)、巨噬细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞等。RNA干扰(RNAi)是指由与靶基因序列具有同源性的双链RNA分子(dsRNA)诱导同源mRNA发生高效且特异性的降解,从而引起基因静默的现象。介导RNA干扰的分子主要包括以下几种:siRNA、微小RNA(microRNA,miRNA,miR)和shRNA等。目前主要依靠两套载体系统以介导RNA干扰分子的导入,即病毒载体及非病毒载体。非病毒载体,尤其是纳米材料级载体,越来越受到国内外研究者的关注。RNA干扰技术作为一种高效的基因沉默技术,是本世纪重大的科技进展之一,近十余年来已在基础生物医学研究领域中得到了广泛应用和快速发展,为许多疾病的治疗提供了新的手段和希望。通过RNA干扰技术选择性沉默肺泡巨噬细胞内相关炎症因子的表达可有效抑制炎症反应,进而达到治疗急性肺损伤的目的。因此我们将肺泡巨噬细胞内的TNF-α mRNA作为RNA干扰的靶点,用于急性肺损伤的抗炎治疗。已开发的大多数阳离子聚合物纳米材料载体由于其不能在体内降解而具有一定的细胞毒性;较高的表面电势往往也会导致这些材料载体被快速清除出体外。针对这些问题,本论文设计了一种还原响应型的非线性阳离子载体材料(BP-S),在降低载体材料的细胞毒性同时,实现siRNA的可控性释放。此外,我们在纳米复合物的表面包载羧基功能化甘露聚糖(Man-COOH),从而降低复合物的表面电势,提高复合物的体内循环时间;同时外包的羧基功能化甘露聚糖(Man-COOH)能特异性识别巨噬细胞表面的甘露糖受体,从而增强巨噬细胞对复合物的摄取,提高复合物的转染效率以有利于对急性肺损伤的治疗。第一部分 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-α的制备及表征目的:合成聚合物BP-S、BP-C、LP,纳米复合物BP-S/siRNA、BP-C/siRNA、LP/siRNA、M/BP-S/siRNA,并对它们进行表征。方法:首先合成2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯(SSDA),然后通过A2+B3+C2迈克尔加成聚合的方法分别成功合成了新型还原可降解的支化聚β-氨基酯BP-S、不敏感的BP聚合物BP-C以及线性聚合物LP。将各聚合物与siRNA混合分别形成纳米复合物BP-S/siRNA、BP-C/siRNA、LP/siRNA。将羧基功能化的甘露聚糖(Man-COOH)与BP-S/siRNA复合物混合最终合成纳米复合物M/BP-S/siRNA。使用400 MR核磁共振氢谱(1H NMR)对2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯(SSDA)和BP-S进行表征。使用凝胶渗透色谱法(GPC)、动态光散射(DLS)、琼脂糖凝胶电泳实验、肝素钠置换实验对各聚合物和纳米复合物进行表征。结果:通过400 MR核磁共振氢谱(1H NMR)对2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯(SSDA)的表征,我们证明含有二硫键的还原敏感单体合成成功。通过凝胶渗透色谱法(GPC)对各聚合物进行表征,我们证明了BP-S、BP-C以及LP等三种聚合物的分子量之间的差异并不显著。通过400 MR核磁共振氢谱(1H NMR)表征BP-S的结构证明了BP-S的高度支化结构,通过凝胶渗透色谱法(GPC)证明了BP-S的还原敏感性。使用动态光散射(DLS)表征二元纳米复合物BP-S/siRNA和三元纳米复合物M/BP-S/siRNA的粒径和表面电荷,证明了这种结构更有利于细胞对它们的摄取。通过动态光散射(DLS)、琼脂糖凝胶电泳实验、肝素钠置换实验,我们证明了BP-S/siRNA复合物可以高效缩合siRNA且具有还原敏感性。最后,我们在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中对纳米复合物的粒径进行了监测,证明了M/BP-S/siRNA具有良好的血清稳定性。结论:二元纳米复合物BP-S/siRNA可以高效缩合siRNA且具有还原敏感性,更有利于siRNA的可控性释放。三元纳米复合物M/BP-S/siRNA相比二元纳米复合物BP-S/siRNA具有更好的血清稳定性。第二部分 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-αα的细胞学研究目的:对纳米复合物 BP-S/siRNA、BP-C/siRNA、LP/siRNA 以及 M/BP-S/siRNA进行一系列的细胞学研究,以验证各种纳米复合物的细胞内动力学、细胞毒性以及体外基因沉默效率等特点。方法:使用流式细胞技术针对小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7 cells)摄取各纳米复合物做定量检测。使用流式细胞技术针对加用甘露聚糖后的小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7 cells)对M/BP-S/FAM-siRNA、BP-S/FAM-siRNA的摄取做定量检测。同时使用人正常胚肺成纤维细胞(MRC-5 cells)作为对照组细胞进行相关的定量检测。使用共聚焦显微技术研究各纳米复合物的内涵体逃逸情况和各纳米复合物的siRNA的胞内释放情况。使用MTT法研究各纳米复合物在小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7 cells)中的细胞毒性。使用酶联免疫吸附实验(ELISA)定量检测小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7 cells)外的TNF-α蛋白的表达水平。使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)测定小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7 cells)内的TNF-αmRNA的表达水平。结果:流式细胞技术的结果提示:小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7 cells)对M/BP-S/FAM-siRNA、BP-S/FAM-siRNA、BP-C/FAM-siRNA等的摄取水平均较高(以三元纳米复合物M/BP-S/FAM-siRNA的摄取水平最佳),明显优于商业转染材料PEI/FAM-siRNA和LP/FAM-siRNA。在甘露聚糖存在的情况下,小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7 cells)对M/BP-S/FAM-siRNA的摄取水平明显下降,而BP-S/FAM-siRNA的摄取水平几乎未发生明显变化。人正常胚肺成纤维细胞(MRC-5 cells)对M/BP-S/FAM-siRNA与BP-S/FAM-siRNA的摄取水平相差不大。的甘露聚糖存在的情况下,人正常胚肺成纤维细胞(MRC-5 cells)对M/BP-S/FAM-siRNA的摄取水平和BP-S/FAM-siRNA的摄取水平几乎未发生明显变化。共聚焦显微技术的结果提示:相比于二元纳米复合物BP-S/FAM-siRNA,三元纳米复合物M/BP-S/FAM-siRNA更能有效逃逸内涵体。相比于BP-C,BP-S更能实现siRNA的胞内释放。MTT法的结果提示:就纳米材料本身的细胞毒性而言,聚合物BP-S以及聚合物LP的细胞毒性小于聚合物BP-C;聚合物BP-S、聚合物BP-C以及聚合物LP的细胞毒性均明显小于商业转染材料PEI。随着各聚合物/siRNA质量比的逐渐增大,各纳米复合物的细胞毒性也逐渐变大。各纳米复合物中以M/BP-S/siRNA的细胞毒性最小,LP/siRNA及BP-S/siRNA的细胞毒性较小,BP-C/siRNA的细胞毒性较大,PEI/siRNA的细胞毒性最大。酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果提示:随着聚合物BP-S/siTNF-α质量比的不断增加,BP-S/siTNF-α抑制TNF-α蛋白表达量的能力逐渐增加。当聚合物BP-S/siTNF-α质量比为30时,其抑制TNF-α蛋白表达量的能力最佳。Man-COOH与BP-S/siRNA质量比在0.3时,其抑制TNF-α蛋白表达量的能力最佳。在所有纳米复合物中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α蛋白表达量的能力最佳,明显优于纳米复合物BP-S/siTNF-α以及纳米复合物BP-C/siTNF-α。纳米复合物BP-S/siTNF-α抑制TNF-α蛋白表达量的能力排第二,明显优于纳米复合物BP-C/siTNF-α以及纳米复合物LP/siTNF-α。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)的结果提示:在所有纳米复合物中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α降低细胞内TNF-α mRNA表达水平的能力最好,显著优于纳米复合物BP-S/siTNF-α以及纳米复合物BP-C/siTNF-α。纳米复合物BP-S/siTNF-α降低细胞内TNF-α mRNA表达水平的能力排第二,明显优于纳米复合物BP-C/siTNF-α以及纳米复合物LP/siTNF-α。结论:三元纳米复合物M/BP-S/siRNA相比于其他二元纳米复合物(BP-S/siRNA、BP-C/siRNA、LP/siRNA)具有细胞摄取率高、能有效逃逸内涵体、更容易实现siRNA的胞内释放、细胞毒性小、基因沉默效率高等优势。第三部分 小鼠急性肺损伤模型的制备目的:通过气管滴注LPS以建立小鼠急性肺损伤模型,为后续实验的开展打下坚实的基础。方法:选取健康雄性6～8周龄的BALB/c小鼠共8只,体重均在18-20 g范围之内,将所有小鼠随机分为2组,分别为LPS组和正常组,每组各4只。LPS组小鼠使用气管内滴注LPS溶液(2.5 mg/kg)诱导急性肺损伤。正常组小鼠气管内滴注等容量的0.9%无菌生理盐水。造模24小时后处死小鼠并收集小鼠的肺组织。评估两组小鼠的肺组织病理情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定肺组织中TNF-α的表达水平,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)测定肺组织中TNF-a mRNA的表达水平。结果:小鼠的肺组织病理情况结果提示:正常组小鼠的肺组织形态基本正常,而LPS组小鼠的肺组织可见明显的病变改变。LPS组小鼠肺组织病理评分明显高于正常组,其差异有统计学意义(p<0.05)。酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果提示:LPS组小鼠肺组织中TNF-α的表达水平明显高于正常组。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)的结果提示:LPS组小鼠肺组织中TNF-α mRNA的表达水平明显高于正常组。结论:LPS能显著诱导小鼠产生急性肺损伤,动物模型建模成功,这为我们后续实验的开展奠定了坚实的基础。第四部分 羧基化甘露聚糖/还原响应型支化聚β-氨基脂/siTNF-α对LPS诱导急性肺损伤小鼠的保护作用与机制的研究目的:利用各种纳米复合物治疗小鼠的急性肺损伤并研究各种纳米复合物的体内抗炎效率和生物安全性。方法:选取健康雄性6～8周龄的BALB/c小鼠共24只,体重均在18-20g范围之内。将所有小鼠随机分为6组,分别为正常组、LPS组、M/BP-S/siNC组、PEI/siTNF-α组、BP-S/siTNF-α组以及M/BP-S/siTNF-α组,每组各4只。LPS组小鼠使用气管内滴注LPS溶液(2.5 mg/kg)诱导急性肺损伤。正常组小鼠气管内滴注等容量的0.9%无菌生理盐水。M/BP-S/siNC 组、PEI/siTNF-α组、BP-S/siTNF-α 组以及M/BP-S/siTNF-α组小鼠分别在LPS诱导2小时后于气管内滴注相应的纳米复合物(均为500μg siRNA/kg)溶液。造模24小时后处死小鼠,收集小鼠的心肝脾肺肾等组织,收集小鼠支气管肺泡灌洗液,收集小鼠动脉血和静脉血。纳米复合物的体内抗炎效率研究包括:使用酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫荧光法分析评估小鼠肺组织中的TNF-α和IL-6的表达水平。使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)测定小鼠肺组织中TNF-α mRNA的表达水平。使用比色法测定小鼠肺组织中髓过氧化物酶(MPO)表达水平。使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-6的表达水平。使用BCA蛋白定量分析测定小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白质的表达水平。对小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞计数进行测定。评估各组小鼠的肺组织病理情况。小鼠血气分析的测定。纳米复合物的生物安全性研究包括:小鼠血常规及血生化检测,小鼠各器官(心、肝、脾、肺、肾)的病理学评估。结果:酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果显示:在小鼠肺组织中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α和IL-6表达的能力最佳,其次是纳米复合物BP-S/siTNF-α,再次是商业转染材料PEI/siTNF-α。M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α和IL-6表达的能力明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α,其差异有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光染色的结果显示:在小鼠急性肺损伤模型中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α能最有效的沉默TNF-α mRNA并降低TNF-α以及IL-6的表达水平。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)的结果显示:在所有纳米复合物中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α降低小鼠肺组织中TNF-α mRNA表达水平的能力最佳,明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α,其差异有统计学意义(p<0.05)。BP-S/siTNF-α降低小鼠肺组织中TNF-α mRNA表达水平的能力排在第二,明显优于商业转染材料PEI/siTNF-α。肺组织中髓过氧化物酶(MPO)的测定结果显示:小鼠气管内滴注三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α后,小鼠肺组织中MPO的表达水平显著降低,明显低于BP-S/siTNF-α组和商业转染材料PEI/siTNF-α组,其差异有统计学意义(p<0.05)。酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果显示:在小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中,三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α和IL-6蛋白表达水平的能力最佳,其次是二元纳米复合物BP-S/siTNF-α,再次是商业转染材料PEI/siTNF-α。M/BP-S/siTNF-α抑制TNF-α和IL-6蛋白表达水平的能力明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α,其差异有统计学意义(p<0.05)。小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白质表达水平测定和细胞计数测定的结果显示:经三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α给药之后,小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白质的表达水平和细胞总数均大幅下降,且明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α和商业转染材料PEI/siTNF-α给药的效果,其差异有统计学意义(p<0.05)。小鼠肺组织的病理学评估结果显示:经三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α给药之后,小鼠的肺部炎症反应明显缓解,小鼠肺组织的破坏程度明显减轻。而BP-S/siTNF-α组和PEI/siTNF-α组小鼠的肺组织中仍然可以见到比较明显的病理改变。三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α组小鼠肺组织的病理评分与正常组之间的差异不明显,但明显小于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α组和商业转染材料PEI/siTNF-α组,其差异有统计学意义(p<0.05)。小鼠血气分析的结果显示经三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α给药之后,小鼠的动脉血氧分压(Pa02)明显上升,二氧化碳分压(PaC02)显著下降,pH逐渐接近至正常组的pH水平,其治疗效果明显优于二元纳米复合物BP-S/siTNF-α和商业转染材料PEI/siTNF-α,差异具有统计学意义(P<0.05)。小鼠血常规及血生化的结果显示:三元纳米复合物M/BP-S/siTNF-α组小鼠的血常规检测结果及血生化检测结果与正常组的相比差异不显著;而商业转染材料PEI/siTNF-α组小鼠血常规及血生化检测中的某些指标与正常组的相比差异明显。小鼠各器官(心、肝、脾、肺、肾)的病理学评估的结果显示:M/BP-S/siTNF-α组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等组织的形态结构与正常组的相比未见明显差异。结论:M/BP-S/siTNF-α可以在小鼠肺组织中介导高效的TNF-α mRNA沉默以有效缓解炎症症状,有利于小鼠急性肺损伤的抗炎治疗,同时M/BP-S/siTNF-α还有具有生物安全性高,无组织器官毒性等优点。