目的：　　通过杂交瘤技术制备出可以特异性识别中药重楼活性成分甾体皂苷的单克隆抗体，并建立其简单灵敏快速、可批量测定的ELISA检测方法，应用于重楼药材及其中成药中甾体皂苷的定性定量研究。　　方法：　　1、高碘酸钠法合成人工抗原，采用红外光谱法、荧光光谱法、SDS-PAGE进行人工抗原的鉴定；MALDI-TOF-MS法测定人工抗原偶联率。　　2、杂交瘤技术制备抗重楼甾体皂苷的单克隆抗体。包括免疫小鼠，间接ELISA法测定血清抗体效价；选择效价最高的小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞sp2/0在PEG作用下进行融合，HAT培养基筛选，间接ELISA法检测细胞上清液，筛选出阳性孔，扩大培养后，icELISA法进行杂交瘤细胞上清液特异性分析，筛选出理想的杂交瘤细胞株。　　3、单克隆抗体的扩大培养、分型鉴定、纯化和纯度鉴定，MALDI-TOF-MS测定分子量。　　4、icELISA检测条件的建立，考察下列条件对IC50值的影响，包括最佳包被浓度、最佳包被条件、最佳抗体工作浓度、封闭液、封闭时间、抗原抗体作用时间、底物显色时间、有机溶剂浓度对ELISA检测结果的影响以及最佳钠离子浓度等。　　5、单克隆抗体的特性鉴定，包括效价测定、特异性考察、敏感性测定和亲和性测定。　　6、将建立好的icELISA法进行方法学验证，包括精密度、线性范围、检测限、加样回收率、重复性等的考察；并对icELISA法和HPLC-ELSD的相关性进行分析。　　7、应用已建立的icELISA法对不同批次的商品重楼药材和市售中成药云南白药、季德胜蛇药、宫血宁胶囊中总甾体皂苷的含量进行测定，并与HPLC-ELSD法的测定结果进行比较。　　结果：　　红外光谱法、荧光光谱法、SDS-PAGE法的结果说明，高碘酸钠法成功合成了人工抗原CⅡ-BSA、CⅡ-HSA和CⅡ-OVA，MALDI-TOF-MS法成功测定其偶联率分别为6，8和3。间接ELISA法检测免疫小鼠效价达51200以上，免疫效果良好。细胞融合后融合率达81.2％，融合效率高。经间接ELISA法检测、不同包被抗原筛选和细胞克隆化筛选得到杂交瘤细胞株编号为MAb1H4-A9。获得的MAb1H4-A9为IgG1型，κ链；分子量为149643。　　icELISA法的考察结果表明，当包被抗原为CII-HSA，最佳包被浓度为1μg/mL，4℃过夜包被，最佳单抗工作浓度为1:5000，封闭液为5％脱脂奶粉，封闭时间1.5小时，抗原抗体工作时间1小时，底物显色时间20分钟，甲醇作为样品溶解试剂且浓度低于10％，钠离子最佳浓度为0.15mol/L时，所建立的间接竞争ELISA法最灵敏。单抗效价达256000，特异性识别重楼中的两大类甾体皂苷，即异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元为母核的甾体皂苷，敏感性为253ng/mL，亲和力为1.47×1010L/mol。icELISA方法学验证结果为，线性方程y=-35.95x+139.1，R2=0.993，检测范围2.6-0.02μg/mL，最低检测限为5ng/mL；加样回收率在95％-105％之间，批内和批间精密度RSD均小于5％，重复性RSD为0.649％，并和HPLC-ELSD法相关性良好，R2=0.992。运用所建立的icELISA法对不同批次的重楼药材和中成药云南白药、季德胜蛇药、宫血宁胶囊中总甾体皂苷含量测定的结果与HPLC-ELSD法基本一致。　　结论：　　本研究成功制备了重楼甾体皂苷的人工抗原，并符合动物免疫的要求；所获得的单克隆抗体1H4-A9具有较强的特异性；所建立的ELSA法检测灵敏度可达到ng级，且与HPLC-ELSD法具有良好的相关性。本研究首次将免疫学技术应用于重楼的活性成分甾体皂苷的分析研究中，突破了传统仪器分析方法在检测该类化合物中的局限，为免疫分析技术应用于中药活性成分的检测提供理论基础和参考，为中药的质量控制提供新的思路和方法。