论文部分内容阅读
肝癌是发病居第五位和死亡率居第三位的恶性肿瘤。中国是肝癌高发地区,占世界肝癌死亡率的一半以上。传统的治疗肝癌的效果不佳并且具有预后差的特点。目前,肝癌相关基因的研究对肝癌的预防和治疗具有非常重要的意义。HCR2是我们实验室采取同源克隆的方式得到的一个基因,之前的研究表明HCR2在肝癌组织中显著下调。在本研究中,我们进一步检测了59对肝癌组织样本,发现肝癌组织中的HCR2的表达水平明显低于相应的癌旁组织,mRNA水平和蛋白水平显示一致的结果。进一步研究发现组织缺氧和乙肝病毒X蛋白均能引起肝癌细胞内HCR2的表达。为了研究HIF1α对HCR2表达水平的影响,我们在Hep3B和HepG2细胞中瞬时转染HIFlα,显示HIF1α降低了细胞内HCR2的mRNA水平和蛋白水平。对HCR2基因的启动子区进行分析,发现HCR2的启动子区存在两个ARNT(HIF1β)的结合位点。我们扩增了含有两个ARNT(HIF1β)结合位点的启动子序列,用荧光素报告系统检测其活性,实验表明ARNT对此启动子具有转录激活作用。用定点突变的方式研究ARNT与启动子的结合位点,预测的位点(-358bp)一(-353bp)和(-1538bp)-(-1533bp)确实影响HCR2的转录活性。同时,我们用染色质免疫共沉淀的实验证实ARNT与HCR2启动子序列直接相互作用。进一步的实验证明,ARNT可以激活HCR2启动子的转录并增加HCR2蛋白的表达量,ARNT对HCR2蛋白的上调表达作用可以被HIF1α抑制。在实验中,我们还发现ROS刺激可以通过降低细胞内ARNT的蛋白水平从而抑制HCR2的表达。总之,在肝癌的发生过程中,细胞缺氧、乙肝病毒X蛋白和ROS的积累共同导致肝癌细胞中内源HCR2的下调表达。为了研究HCR2在肝癌发展中作用,我们在Hep3B和SMMC7721肝癌细胞株中超量表达HCR2和消减内源HCR2,进行生长曲线的测定和克隆形成率实验,结果显示,超量表达HCR2抑制肝癌细胞增殖,消减内源HCR2促进肝癌细胞增殖。我们建立了超量表达外源HCR2的Hep3B细胞稳定株,并进行了裸鼠移植瘤试验,超量表达HCR2的Hep3B稳定株与稳定转染空载体的对照细胞株相比,裸鼠皮下肝癌细胞瘤体的生长速度显著减缓。我们还发现HCR2抑制肝癌细胞增殖的作用与酶的活性相关。我们还研究了HCR2对ROS的作用,发现HCR2可以减少ROS对细胞的损伤,降低细胞内的ROS水平,抑制低浓度ROS对肝癌细胞增殖的促进作用。此结果表明HCR2对细胞内的ROS水平有反馈调节作用,并且提示一种调控细胞内的氧化还原平衡的新的力量。我们的这项研究揭示HCR2是在肝癌的发生和发展中起到重要作用的基因。组织缺氧、乙肝病毒的感染以及肿瘤组织ROS水平的升高都是肝癌发生的重要因素,我们的研究发现这些因素都会使肝癌组织中的HCR2表达水平降低,HCR2表达水平的降低又会促进肝癌细胞的增殖。因此进一步研究HCR2在肝癌发生和发展中的功能,对今后肝癌的预防和治疗提供了新的机会。羰基还原酶(carbonyl reductse 1,CBR1,Genbank No.J04056),可以还原代谢蒽环类抗肿瘤药物柔红霉素(DNR),生成相应的醇代谢物柔红霉素醇。代谢产物与药物原型比较,抗肿瘤效果显著减弱,还会导致心脏毒性,使得蒽环类药物在临床应用上受到限制。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶中的天然活性成分,自身没有很强的抗肿瘤作用,但是由于其毒性低的特点,可以作为肿瘤治疗的辅助剂。在研究过程中发现,EGCG与CBR1有很好的结合亲和性,EGCG可以和CBR1直接结合。EGCG证实为CBR1的非竞争性抑制剂,中性和弱碱性条件,具有很强的抑制CBR1的活性的能力。在肝癌细胞株中,EGCG通过抑制CBR1对柔红霉素的代谢作用,增强了柔红霉素的抗肿瘤效果,包括增强柔红霉素对肝癌细胞增殖的抑制作用,还能增强药物的促凋亡作用。为了验证EGCG可以抑制细胞对柔红霉素的代谢,我们使用HPLC来分离和测定细胞裂解液中的柔红霉素代谢物——柔红霉素醇的含量,随着细胞裂解液中EGCG的浓度升高,柔红霉素醇的含量梯度降低,说明EGCG可以有效的抑制CBR1对柔红霉素的代谢作用。为了在整体动物水平检测EGCG和柔红霉素联用的效果,以及EGCG对CBR1的靶向性,我们建立检测化合物体内作用的人肝癌细胞SMMC7721和Hep3B裸鼠移植瘤模型。EGCG对柔红霉素抑制SMMC7721移植瘤生长有显著的增效作用,对Hep3B移植瘤没有显著的增效作用。测定药物作用前后裸鼠的体重变化以及各个药物处理组小鼠肝功能和心脏毒性的变化,结果显示EGCG不仅自身无毒,还可以显著缓解柔红霉素引起心脏毒性和裸鼠体重的减轻。这项研究表明EGCG能有效地抑制CBR1的代谢活性,增强柔红霉素的抗肿瘤作用并降低由柔红霉素引起的心脏毒性。EGCG与柔红霉素的联合使用可以拓展柔红霉素的使用,有望成为今后治疗肝癌的一种新方式。关键字：CBR1 EGCG柔红霉素抑制剂抗肿瘤心脏毒性