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软枣猕猴桃(Actinidia arguta)是我国珍贵的抗寒果树之一,是猕猴桃品种改良的重要种质资源,其果实富含Vc,营养丰富,是新兴的珍贵果品。目前,其野生资源遭到严重破坏,天然基因库受到威胁,而常规保存方法如异地保存与组织培养等易受环境及人为影响,保存能力有限,且占用资源大,因此,探索新的中长期保存方法具有重要意义。超低温保存是目前最为理想且应用最为广泛的种质资源长期保存的方法。本研究分别以软枣猕猴桃休眠芽、茎尖和花粉为试材,研究了休眠芽玻璃化超低温保存方法、组培苗茎尖小滴玻璃化超低温保存方法和花粉的离体保存,旨在建立简单、高效的软枣猕猴桃种质资源保存体系,以期为软枣猕猴桃生产、育种和资源保存提供参考。1.建立了软枣猕猴桃休眠芽玻璃化法超低温保存体系。‘魁绿’单芽茎段最佳的灭菌方法是茎段去皮后用75%酒精浸泡30 s,无菌水洗涤4~5次,然后用0.1%HgCl2灭菌30 min,无菌水洗涤4~5次。灭菌后剥取休眠芽放入0.3 mol·L-1蔗糖+1 mol·L-1甘油的MS预培养液中震荡培养2 d,常温下用2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1蔗糖+MS的装载液处理20 min,0℃条件下用植物玻璃化保护液PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4 mol·L-1蔗糖+MS)处理120 min,换新鲜PVS2保护液后迅速投入液氮冻存。24 h后取出,立即浸入38℃水浴中解冻2 min,然后用含1.2 mol·L-1蔗糖的MS卸载液洗涤30 min,每10 min换一次卸载液。无菌滤纸吸干后将休眠芽接种到MS+2 mg·L-1 6-BA+0.02 mg·L-1 NAA恢复培养基上,暗培养3 d,转到正常光照下培养,成活率达86.30%。用流式细胞仪鉴定再生植株倍性,没有发现差异。用SRAP分子标记法鉴定再生植株的遗传稳定性,未发现变异条带。2.建立了软枣猕猴桃组培苗茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系。无菌条件下剥取2~3 mm的‘魁绿’茎尖,放入含0.3 mol·L-1蔗糖的MS预培养液中震荡培养2 d,常温下用装载液处理40 min,0℃条件下PVS2脱水40~60 min。将茎尖转入铝箔条上的PVS2液滴中,直接投入液氮冻存24 h。取出后立即加入40℃预热的卸载液,待铝箔条上的液滴脱落后换新鲜卸载液洗涤30min。将茎尖用无菌滤纸吸干后接种到恢复培养基中,暗培养3天后转到光下培养,茎尖的成活率可达41.11%以上。3.以软枣猕猴桃‘绿王’的花粉为试材,筛选出花粉离体萌发的最适培养基为5%蔗糖+0.04%硼酸+1%琼脂,培养基中添加不同浓度硝酸钙对花粉萌发起抑制作用;20℃黑暗条件下培养,花粉萌发率最高。软枣猕猴桃‘绿王’、‘A14-5-2’、‘B6-1-1’、‘T7-3-3’和‘T7-6-3’等5份种质的花粉在不同低温条件下保存,花粉萌发率以-80℃为最高,-20℃次之,4℃最差。‘绿王’、‘A14-5-2’和‘T7-6-3’的花粉在-80℃条件下保存12个月,花粉萌发率与保存前无显著差异,萌发率均在84.96%以上。