【摘 要】
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目的:胰腺癌的发病率在全球范围内正在逐年上升,且恶性程度高、起病隐匿、进展迅速、预后极差。遗憾的是,至今尚未明确胰腺癌发生发展的具体机制。本课题前期在临床样本中发
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目的:胰腺癌的发病率在全球范围内正在逐年上升,且恶性程度高、起病隐匿、进展迅速、预后极差。遗憾的是,至今尚未明确胰腺癌发生发展的具体机制。本课题前期在临床样本中发现:胰腺癌患者中存在骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因启动子区CpG岛高甲基化。据此,我们推测BMP-2基因启动子区CpG岛高甲基化可能导致抑癌基因表达下调从而引发胰腺癌。为了进一步证实我们的猜测,我们应用多种方法在临床样本中检测BMP-2甲基化率,同时构建BMP-2基因过表达PANC-1胰腺癌细胞模型体外反向验证BMP-2基因启动子区CpG岛高甲基化与胰腺癌之间的关系,并探索其可能的机制。方法:(1)焦磷酸测序(甲基化率定量):抽提3例胰腺癌(导管腺癌)患者的癌组织和癌旁组织,13例患者和3例健康对照者外周血DNA,经重亚硫酸氢盐转化、纯化及PCR扩增之后,焦磷酸测序分析,测定BMP-2基因启动子区CpG岛甲基化率(以健康对照的外周血及癌旁组织为参照);(2)甲基化特异性PCR(甲基化定性):抽提48例胰腺癌(导管腺癌)患者全血DNA经重亚硫酸氢盐转化、纯化及甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)扩增之后,琼脂糖凝胶电泳测定BMP-2基因甲基化状态;(3)对胰腺癌、胰腺炎患者及健康对照者血清BMP-2进行ELISA定量分析;(4)胰腺癌患者组织H&E染色、免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)分析BMP-2蛋白在癌组织与癌旁组织中的表达差异;(5)构建过表达BMP-2胰腺癌细胞株,用CCK8法检测细胞增殖差异;(6)划痕实验和transwell侵袭实验分别探究两种细胞株的迁移和侵袭能力;(7)提取胰腺癌患者癌组织、癌旁组织及构建细胞的裂解蛋白做Western blot,对可能的通路蛋白进行验证。结果:(1)焦磷酸测序结果表明,与对照组比较,胰腺癌患者中BMP-2基因启动子区CpG岛甲基化率较高;(2)甲基化特异性PCR(MSP)扩增及琼脂糖凝胶电泳结果显示胰腺导管腺癌甲基化率高达77.1%(37/48);(3)ELISA结果表明,胰腺癌患者血清BMP-2浓度(89.14±19.42 pg/mL)显著低于健康对照(102.33±10.54 pg/mL)(P=0.012),且低于胰腺炎患者(101.66±22.29 pg/mL)(P=0.034);(4)免疫组织化学显示胰腺癌组织中BMP-2的表达显著低于癌旁组织;(5)CCK8法测定细胞生长曲线发现,空载细胞增殖速度显著快于过表达BMP-2的PANC-1细胞;(6)划痕实验和transwell侵袭结果显示,空载细胞的迁移和侵袭能力均强于过表达BMP-2组;(7)Western blot结果发现胰腺癌患者癌组织中Smad和PI3K-Akt两条信号通路上相关蛋白的表达低于癌旁组织。过表达BMP-2的胰腺癌细胞中Smad通路上两个关键受体(BMPR2和BMPR1A)蛋白表达高于空载对照组。结论:(1)胰腺导管腺癌患者中存在BMP-2基因启动子区CpG岛高甲基化;(2)过表达BMP-2可抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;(3)BMP-2基因启动子区CpG岛高甲基化可能通过Smad及PI3K-Akt两条信号通路影响胰腺癌的恶性行为。
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