类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种最为常见的自身免疫性疾病,以慢性的关节滑膜炎为特点,逐渐导致关节软骨和骨的破坏甚至关节功能的障碍,极大影响了患者的生活质量。尽管RA的病因尚不十分清楚,近年来的研究显示:活化的成纤维样滑膜细胞,作为滑膜组织局部复杂细胞调控网络中的一员,在RA的发生发展中发挥着重要作用,因而引起了研究人员的极大关注。由于类风湿性关节炎在中晚期病变的复杂性,单一信号转导通路的研究恐难详述其发病机制,因此急需对RA滑膜细胞内复杂的信号转导网络关系进行深入探讨。　　本课题的研究目的就是利用功能基因组学与蛋白质组学的方法探寻RA与正常滑膜表达差异的基因,从而为进一步揭示和阐明RA的病理机制做出贡献。基因表达谱芯片作为生物技术中的新兴工具,使得同时对上万种基因的表达水平进行检测成为可能,我们首先利用表达谱芯片从RNA水平探讨RA滑膜细胞相对于正常与骨性关节炎滑膜细胞差异表达的基因。我们体外分离了RA、骨性关节炎与正常滑膜组织,经原代培养生长至第四代的成纤维样滑膜胞用于实验。分别提取类风湿性关节炎滑膜细胞、骨性关节炎滑膜细胞和正常滑膜细胞的总RNA,反转录成cDNA,并以两种荧光Cy5和Cy3分别进行标记,再与覆盖21073条人类基因的Agilent Human1A表达谱芯片进行杂交,扫描芯片荧光信号,用基因图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析。结果显示,共筛选出RA滑膜细胞与正常滑膜细胞表达显著差异的基因共1816条,其中1250种基因表达水平上调,566种基因表达下调;在上调的基因中,有17种基因上调程度达到在正常中的100倍以上,且上调的基因中有许多都与RA的类肿瘤性质相关,如细胞增殖、粘附、细胞周期调控及侵袭。这些结果提示我们RA的发病是多因素多基因共同作用的结果。RA滑膜与正常滑膜差异表达的1816种基因可能参与了RA的发生和发展,对这些基因进一步进行研究有助于阐明RA的发病机制和找到新的疾病相关关键分子。　　随后我们利用实时定量PCR对芯片结果中8种可能与RA发病相关的基因的表达水平进行了检测,除了MFAP4、ITGA11与芯片检测结果具有相同的方向性,即在RA成纤维样滑膜细胞中表达上调,其余6种基因的实时定量PCR表达水平与芯片结果中不一致,但在经II型胶原刺激的RA滑膜细胞中,这8种基因的表达水平均有显著上调。实时定量PCR结果中与芯片结果表达趋势一致的基因说明,在不同RA患者个体之间,基因表达的改变有规律可循,体现了RA中成纤维样滑膜细胞内信号转导分子的改变对疾病发生发展的影响;而对于PCR结果与芯片结果不符合的基因,我们认为,一方面是由于芯片与实时定量PCR所用的细胞样本来自于不同病理状态的不同个体造成的样本间差异,更为重要的是,体外培养的细胞离开了在体时的细胞外微环境,尤其是RA成纤维样滑膜细胞离开了的在体时充斥着多种免疫介质、细胞因子、细胞外基质等病理状态下复杂的细胞外环境,必将导致其多种基因表达水平发生一定的变化,造成了PCR结果与芯片结果的不完全吻合性。而当我们用II型胶原刺激滑膜细胞,使细胞部分回复在RA病理状态下在体时受到的外环境刺激,从而得到了与芯片一致的结果,也很好的说明了这一点。而在随后我们利用II型胶原刺激正常滑膜细胞的实验中,实时定量PCR结果显示仅有半数基因表达上调,这也很好的说明了处于RA病理状态下的滑膜细胞对于胶原刺激具有独特的应答性。随后我们基于芯片结果,选取了一个具有诱导多种肿瘤细胞增殖和迁移的促癌基因CYR61来进行进一步研究。　　我们克隆获得了CYR61基因的编码区全长序列,利用慢病毒表达系统成功在原代培养的RA成纤维样滑膜细胞中过表达CYR61,并在进一步的实验中证明CYR61蛋白的过表达可以促进RA成纤维样滑膜细胞的侵袭。目前的研究表明,RA关节软骨破坏主要是由过度增殖的滑膜细胞和滑膜组织分泌的基质金属蛋白酶造成的:基质金属蛋白酶降解软骨基质的主要成分II型胶原,而断裂的II型胶原又可作用于滑膜细胞诱导其分泌基质金属蛋白酶,所以阐明II型胶原介导基质金属蛋白酶分泌的关键途径和分子是未来治疗RA和减轻关节软骨破坏的重要突破口。但鉴于类风湿性关节炎中晚期病变发病机制的复杂性,对单一信号转导通路的研究远不能阐明其发病机制,所以需要对滑膜细胞异常增生和侵蚀破坏软骨过程中细胞内复杂的信号转导网络关系进行深入探讨,以期寻找和控制RA发病的上游分子或环节,进而有效的阻止和控制病情的进展。　　我们采用基因芯片技术筛选II型胶原作用后RA成纤维样滑膜细胞内差异表达的基因,结果共筛选出显著表达差异基因34条,其中9种基因表达水平上调,25种基因表达水平下调。用实时定量PCR对芯片结果中上调的基因进行验证,发现除了MRPGRD,其余8个基因均与芯片检测结果具有相同的方向性。反应了芯片结果的较高的可靠性。在这些基因中,涉及细胞周期调控、细胞受体、黏附侵袭等功能的基因,提示II型胶原及其受体介导的信号通路可能是RA关节软骨破坏的关键环节之一,但详细的作用机制及此过程中的关键分子有待于进一步深入研究。MicroRNA与RA病理进程相关的研究刚刚起步,已有研究表明一些microRNA在RA滑膜组织中表达异常。我们利用生物信息学,通过对DDR2、MMP-1、MMP-13、STAT3基因3’-UTR及编码区的分析,预测了可能对这些基因产生调控作用的靶miRNA。接着,在对这些miRNA的实时定量PCR检测中发现:在II型胶原刺激后,miR-16-1、miR-143、miR-29a在II型胶原刺激后的RA成纤维样滑膜细胞中表达下调。提示这些miRNA表达的改变可能共同参与了RA的病理过程,促进了II型胶原介导的RA病程的进展,我们也将进一步探索这些信号调节网络参与RA病理进程的具体作用机制。我们知道,蛋白质磷酸化是最常见、最重要的蛋白翻译后修饰方式之一。在真核细胞中,蛋白质的磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸三个残基上,尽管酪氨酸磷酸化的丰度非常低,但是它在很多重要的生理和病理过程如增殖、分化、凋亡、迁移等中均扮演了重要角色;酪氨酸磷酸化信号转导网络的紊乱通常与许多疾病密切相关,例如癌症。因此酪氨酸磷酸化蛋白质组学不仅在数量上能比较系统的分析某一过程或现象,而且在质量上也提供了基因组所不能给出的信息。　　本文首次应用差异蛋白质组学技术分析了RA成纤维样滑膜细胞内酪氨酸磷酸化蛋白质在胶原刺激前后的表达差异,发现了一个可能与RA发生发展相关的蛋白ANXA5,对其进一步研究发现ANXA5确实参与了II型胶原刺激后RA成纤维样滑膜细胞内酪氨酸磷酸化信号转导通路的活化,但具体机制还需进一步研究。