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神经炎症逐渐被认为是神经退行性疾病发病的重要病理机制,小胶质细胞和星形胶质细胞(astrocyte,AS)炎性因子的分泌,将严重损害周围的神经元。抑制神经胶质细胞过度活化可能是治疗神经退行性疾病的重要靶标。AS来源于神经外胚层,是大脑中分布最广的细胞。一方面,它们通过释放各种神经营养因子在神经元的营养支持中发挥重要作用。另一方面,在病理情况下,反应性AS数量增多会引发炎症反应并最终损害神经元。淫羊藿总黄酮(total flavonoid of Herba Epimedii,HEP)是从小檗科植物淫羊藿的茎叶中提取的总黄酮类成分,主要含有淫羊藿苷(icariin,ICA)和朝藿定B(Epimedin B)等。现代药理学研究发现,HEP是淫羊藿促进免疫功能,参与骨代谢,抗肿瘤,增强心血管活动以及发挥神经保护作用等功能的有效成分。Epimedin B是HEP的单体黄酮类活性化合物,含量仅次于ICA。最近有文献报道了Epimedin B可以刺激大鼠成骨细胞UMR106细胞的增殖和分化,此作用可以被雌激素核受体(estrogen receptor,ER)特异性阻断剂ICI182,780所阻断,但配体结合实验发现Epimedin B不能与ER直接结合,提示可能是通过其他的信号途径激活ER。G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)是一种新型的膜性雌激素受体,雌激素可以通过GPER介导的快速非基因组机制,发挥抗炎和抗凋亡等作用。本课题组的前期工作证明HEP及其主要活性成分ICA能够抑制LPS诱导的AS炎症反应,Epimedin B作为HEP中含量第二高的活性成分,是否也能够抑制AS的炎症反应?其抗炎作用的机制是什么?目前尚未见报道。目的:1.探讨Epimedin B对原代AS炎症反应的抑制作用及其机制;2.探讨Epimedin B对原代AS活动的调控。方法:1.应用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制备的大鼠原代培养的AS炎症模型。采用Real time PCR和Western blot技术检测炎性因子基因和蛋白的表达。siRNA干扰等技术沉默GPER,观察其对Epimedin B抗炎作用的影响。2.Epimedin B单独作用AS,Real-time PCR技术检测其对c-fos、GLAST和GLT-1基因表达的影响。结果:1.Epimedin B抑制原代星形胶质细胞炎症反应的实验研究(1)为验证所培养的原代星形胶质细胞的纯度,我们首先运用免疫荧光技术检测特异性标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)在星形胶质细胞上的表达,结果表明所培养的细胞95%以上为星形胶质细胞。(2)LPS处理星形胶质细胞6 h,能显著使炎性因子TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2mRNA的表达上调(P<0.001)。不同浓度Epimedin B(1、10和20μM)预保护能够剂量依赖式地抑制LPS所诱导的炎症反应,其中10μM的Epimedin B抗炎保护作用最强(P<0.05),所以后续试验选用10μM浓度的Epimedin B。(3)GPER特异性阻断剂G15(1μM)能够阻断Epimedin B对LPS诱导的TNF-α、IL-1β、COX-2 mRNA表达的抑制作用,并且差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.01),但对iNOS mRNA的作用没有阻断效果。雌激素核受体ER特异性阻断剂ICI182,780不能明显阻断Epimedin B对LPS诱导的炎性因子基因表达的抑制作用。(4)G15和ICI182,780能够明显阻断Epimedin B对LPS诱导的COX-2的蛋白表达的抑制作用(P<0.01,P<0.05),对iNOS的表达有一定的阻断效应但差异不显著(P>0.05)。(5)siRNA干扰可以明显减低原代星形胶质细胞GPER mRNA和蛋白的表达(P<0.001,P<0.01),敲减率分别为60%和50%。(6)运用siRNA沉默GPER的基因表达后,Epimedin B对LPS诱导的TNF-α、IL-1β、COX-2基因表达的抑制作用显著减弱(P<0.05)。(7)运用siRNA沉默GPER的基因表达后,Epimedin B对LPS诱导的COX-2蛋白表达的抑制作用亦明显减弱(P<0.05)。2.Epimedin B调控星形胶质生理功能的实验研究(1)Epimedin B单独处理星形胶质细胞1、2、3、4 h,Real time PCR结果显示,即可早期基因c-fos在1 h升高最明显(P<0.01),差异有统计学意义(P<0.05),提示Epimedin B能够激活星型胶质细胞。(2)谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)的mRNA表达在Epimedin B处理3 h时显著升高(P<0.05),谷氨酸转运体1(GLT-1)mRNA的表达Epimedin B处理4 h时显著升高(P<0.05),提示Epimedin B能够调控星型胶质细胞的生理功能。结论:实验结果表明,Epimedin B能够抑制星形胶质细胞的炎症反应,雌激素膜受体GPER可能是其主要的作用靶点。Epimedin B可以调控星形胶质细胞的生理功能,对于维护其周围内环境稳态具有重要意义。