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研究背景:前交叉韧带(Anterior cruciate ligament,ACL)损伤是青壮年尤其是竞技体育运动者中最常见的膝关节韧带损伤之一。临床上以ACL重建术为其治疗的主要方法。但ACL重建术并不能降低ACL损伤所继发的创伤性关节炎(Post-traumatic osteoarthritis,PTOA)发生的风险和进程。最新的研究表明,在关节创伤后一周内关节腔即出现大量的炎症因子及氧自由基等,促使大量的软骨细胞凋亡,成为启动PTOA关节软骨退变和损伤的始动因素。因此及早抑制这些炎性因子的活性对阻止或者减缓PTOA的发展至为关键。α-2巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin,A2M)作为一种广谱的蛋白酶抑制剂在关节软骨损伤时被合成和分泌到关节液中,可有效地抑制IL-1诱导软骨基质降解的基质金属蛋白酶(MMP-3、9、13)和多种炎症因子(IL-1β、6、8,TNF-a和GM-CSF)的活性,但其在关节软骨损伤后血清和关节液中分泌情况却一直未见相关研究。本课题组在前期研究中也已经证实采用前交叉韧带切断术(Anterior cruciate ligament transection,ACLT)制作的SD大鼠的创伤性关节炎(PTOA)模型中,适量的补充外源性的A2M可以明显的减缓关节软骨的退变进程,具有非常显著的正性关节软骨保护作用。但所使用的A2M为大分子量蛋白质,免疫原性强,异种A2M长期关节腔注射极有可能引起免疫反应,因此寻求一种更加简单的提纯或富含A2M血清的方法并观察其对创伤性关节炎(PTOA)的治疗效果具有非常重要临床价值。研究目的:1)分析A2M在ACL损伤时血清、关节液中的分布变化,明确与关节软骨退化存在的关联,为外源性补充A2M提供理论依据;2)采用超滤离心法制备富含A2M血清(A2M-Rich Serum,A2MRS),检测A2MRS中的A2M的蛋白浓度及蛋白活性,并分析其分子生物学特性;3)观察富含A2M血清(A2M-Rich Serum,A2MRS)对创伤性关节炎(PTOA)的关节软骨是否具有明显的治疗效果或减缓关节软骨退化的作用。研究方法:1)首先以2月龄96只SD大鼠为实验对象,分为两组,每组48只。实验组通过前交叉韧带切断术(Anterior cruciate ligament transection,ACLT)建立PTOA动物模型,对照组采取假手术切开,不行ACLT。术后3天及1、2、4、8及12周每个时间点各组处死8只大鼠,收集血清及膝关节盥洗液。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠ACL损伤后不同时间点的关节盥洗液、血清中A2M的浓度变化规律,同时采用番红O固绿染色观察PTOA随着时间的延长其关节软骨退化的病理进程与体液中A2M的含量变化是否存在某种关联,探讨A2M是否可以作为关节软骨退变早期诊断及监测病理进程的生物标记物,为外源性补充A2M提供理论依据。2)采用超滤离心法制备富含A2M血清(A2M-Rich Serum,A2MRS),采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白免疫印迹法(Western Blot)等方法检测其分子生物学性质。3)选取80只健康成年SD大鼠,分为4组,每组20只:Sham+Saline(空白对照组)、ACLT+HA2MRS(高剂量组)、ACLT+LA2MRS(低剂量组)、ACLT+Saline(阳性对照组)。手术后3天、2周、4周依据分组的不同关节腔定时注射30ul生理盐水或30ul不同浓度A2MRS(高剂量组A2M为20ug/ul,低剂量组A2M为10ug/ul)。每个时间点治疗后24小时关节腔注射MMP680免疫荧光探针,采用荧光分子断层成像系统(Fluorescence Molecular Tomography,FMT)动态检测基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)在关节液中浓度的变化,观察A2MRS对基质金属蛋白酶是否具有抑制作用。术后8周统一处死动物,小动物X线片观察膝关节退变的影像学表现,印度墨水染色评估关节软骨大体损伤情况,并行Mankin’s评分;胫骨平台关节软骨采用甲苯胺蓝、番红O固绿染色、苏木精-伊红染色(HE染色)和免疫组化法观察A2MRS对PTOA软骨病理退变是否具有减缓或者修复作用,采用OARIS评分系统评估关节软骨的病理变化并作统计学分析;股骨髁关节软骨采用实时荧光定量PCR法(RTPCR)对软骨组织中II型胶原(COL-II)、X型胶原(COL-X)、基质金属蛋白酶3、13(Matrix metalloproteinase,MMP-3、13)、软骨聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Runt蛋白相关转录因子-2(Runt-related transcription factor,Runx2)等指标进行检测,评估富含A2M血清对关节软骨损伤在基因层面上的调控作用。采用ELISA检测关节液中基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP-13)浓度。结果:1)ACLT术后实验组与对照组的关节软骨早期大体观察与组织病理学观察并无明显的区别,但术后8周开始,实验组的关节软骨退化明显加重。实验组术后3天、1周、8周关节盥洗液中A2M的浓度较血清中的浓度明显增高。并且实验组术后3天关节液盥洗液中的A2M的浓度与对照组关节盥洗液中A2M浓度相比较明显增高,术后1周开始迅速降低与对照组无差别。2)采用超滤离心法制备的富含A2M血清(A2M-Rich Serum,A2MRS)经ELISA检测结果为:人的血清中A2M的浓度为2.43±0.66mg/ml,富含A2M血清(A2MRS)中A2M的浓度为19.52±4.37mg/ml,A2MRS中的A2M的浓度较正常血清中的浓度提高了8.04倍。蛋白免疫印迹(Western Blot)结果显示:富含A2M血清(A2MRS)相比正常血清在180k D处有非常明显的蛋白浓聚现象。A2M蛋白活性检测表明:富含A2M血清(A2MRS)的A2M蛋白活性较正常血清A2M的活性提高2.13倍。3)动物体内实验观察A2MRS对PTOA关节软骨退化的治疗作用,通过荧光分子断层成像系统(Fluorescence Molecular Tomography,FMT)检测结果表明:富含A2M血清(A2MRS)早期可以明显抑制创伤性关节炎关节液中基质金属蛋白酶3、13(Matrix metalloproteinase,MMP-3、13)。膝关节的X光片的影像学表现:ACLT+Saline组的髌骨下缘有明显的骨赘增生,其余三组在影像学表现上均没有观察到明显的退行性改变。印度墨水染色表明:Sham+Saline组中软骨表面未见明显损伤,ACLT+Saline组软骨表面损伤最为严重,而ACLT+A2MRS组关节面损伤明显减轻,其中ACLT+HA2MRS组中软骨损伤在ACL切断组中最小,改良Mankin’s评分显示:ACLT+HA2MRS组和ACLT+LA2MRS与ACLT+Saline组相比较均有明显统计学意义,但ACLT+HA2MRS组与ACLT+LA2MRS组相比较无统计学意义。胫骨平台番红O固绿染色、HE染色及甲苯胺蓝染色结果均显示:ACLT+Saline组软骨厚度明显变薄,软骨表面有较多小的裂隙,软骨细胞分布紊乱,糖胺多糖染色较差。ACLT+LA2MRS组软骨细胞聚集成团,软骨厚度降低,ACLT+HA2MRS组中软骨表面较为平滑,细胞排列较整齐,Sham+Saline组软骨表面完整,结构良好,细胞分布均匀,糖胺多糖染色良好。OARIS评分显示:ACLT+Saline组为10.15±2.88,ACLT+HA2MRS组为5.54±2.61,ACLT+LA2MRS组为4.87±2.74,Sham+Saline为3.05±1.39,统计学分析表明:两个实验组(ACLT+HA2MRS和ACLT+LA2MRS)与阳性对照组(ACLT+Saline)均有显著性差异(p<0.0001),两个实验组(ACLT+HA2MRS和ACLT+LA2MRS)与空白对照组(Sham+Saline)均有显著性差异。而ACLT+HA2MRS组与ACLT+LA2MRS组之间经统计学分析不具有显著性差异(p=0.22)。在II型胶原的免疫组化染色上,ACLT+HA2MRS组和ACLT+LA2MRS组的阳性细胞明显比ACLT+Saline组染色强,即ACLT+HA2MRS组较ACLT+LA2MRS组阳性细胞要强,但两组II型胶原的免疫组化染色均低于Sham+Saline组。在X型胶原和MMP-13的免疫组化染色上,ACLT+Saline组阳性细胞在四组中表达最强,Sham+Saline组的阳性细胞表达最弱,而两个治疗组ACLT+HA2MRS组及ACLT+LA2MRS组在X型胶原表达上介于ACLT+Saline组与Sham+Saline组之间,并且同样存在剂量依赖性,即ACLT+HA2MRS的X型胶原的表达比ACLT+LA2MRS组弱。RT-PCR结果表明A2MRS具有较为明显的抑制负性基因X型胶原(COL-X)、基质金属蛋白酶3、13(Matrix metalloproteinase 3、13,MMP-3、13)、Runt蛋白相关转录因子-2(Runt-related transcription factor,Runxn2)的m RNA表达。关节液中MMP-13的ELISA测定结果表明:ACLT+HA2MRS组、ACLT+LA2MRS组与Sham+Saline组中关节液中MMP-13浓度均显著低于ACLT+Saline,统计学分析有显著性差异,但前三组之间组相比均无统计学差异。结论:1.关节液中A2M可以作为生物标记物早期诊断创伤性关节炎,术后一周关节液中A2M的迅速降低提示外源性的补充至关重要。2.超滤离心法可高效便捷的制备具有较高蛋白浓度和蛋白活性的富含A2M血清。3.富含A2M血清(A2MRS)具有较为明显减缓关节软骨退化的正性治疗作用。