论文部分内容阅读
恶性肿瘤的发病率和致死率甚高,成为当今世界人类疾病中的头号杀手。常规的三大疗法(手术、化疗和放疗)对肿瘤的治愈率很低,并存在很大的毒副作用。近年兴起的肿瘤生物疗法及细胞疗法给肿瘤治疗带来了新的希望。已知人肿瘤坏死因子α(hTNFα)具有较强的杀伤或抑制肿瘤组织细胞生长的作用,已用于临床治疗某些肿瘤。但由于该因子的半衰期短,静脉全身用药后到达肿瘤组织的浓度低、持续时间短,难以达到满意的抑瘤效果;并且大剂量的使用会引发严重的寒战、高热及休克等全身不良反应,极大地限制了其在临床的应用。本组前期以人胚肾293细胞为载体,构建了能持续分泌hTNFα的hTNFα/293细胞;以APA微囊包裹该细胞,制备出APA-hTNFα/293细胞微囊;将该细胞微囊植入荷瘤裸鼠肿瘤组织内部及周围;结果初步表明在APA微囊发挥免疫隔离作用的前提下,该细胞微囊可在肿瘤组织局部发挥持续释放hTNFα、抑制肿瘤组织生长的效应。具有提高肿瘤组织局部hTNFα浓度、延长作用时间、降低全身不良反应的优点,可更好地发挥抑制肿瘤组织细胞生长的作用。作为全新的抑瘤方法,是否能在多种载体细胞及抑瘤实验中得到证实,需进一步的扩展性研究。本研究采用常用的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)作为载体细胞,应用脂质体转染技术,构建hTNFα/CHO基因工程细胞;采用APA微囊包裹该基因工程细胞,制备APA-hTNFα/CHO细胞微囊;植入荷瘤鼠肿瘤组织内部及周围,以期利用APA微囊克服异基因细胞的免疫排斥反应,通过hTNFα/CHO细胞提供持续分泌和释放hTNFα的微型生物泵作用,达到维持肿瘤组织局部高浓度hTNFα、全身其他组织低浓度hTNFα的效应,以更好地发挥hTNFα的抑瘤作用,并降低全身不良反应,旨在为恶性肿瘤的治疗提供全新的生物治疗方法。一、实验目的:构建hTNFα/CHO基因工程细胞;制备APA-hTNFα/CHO细胞微囊;在体内、外实验中了解该细胞微囊对肿瘤组织细胞生长的抑制效应及对宿主的毒副作用。二、实验内容:应用脂质体转染技术,构建hTNFα/CHO基因工程细胞;在体外实验中证明该细胞可持续释表达hTNFα基因并分泌放人肿瘤坏死因子α;用ELISA法检测该细胞培养液中hTNFα蛋白的含量。用APA微囊包裹所构建的细胞系,制备出APA-hTNFα/CHO细胞微囊。将APA-hTNFα/CHO细胞微囊与9种不同的人肿瘤细胞共培养,观察该细胞微囊对不同人肿瘤细胞的生长是否具有抑制作用。选取2肿肿瘤细胞制备APA细胞微囊,将该细胞微囊植入荷瘤裸鼠的肿瘤组织内部和周围,了解其对荷瘤裸鼠肿瘤组织的生长是否具有抑制作用,及其对宿主体重和生存的影响。三、实验方法:1、构建htnfα/cho基因工程细胞系:采用pcr技术对htnfα目的基因进行合成并扩增。通过质粒酶切与重组技术,将合成的目的基因整合入质粒gv141中,并检测目的基因整合水平。使用脂质体(lipofectamine2000)将整合htnfα目的基因的重组质粒gv141转染入cho细胞中,通过g418抗性筛选,构建出基因工程细胞htnfα/cho细胞系。提取筛选后扩增的该细胞的总rna,采用pt-pcr方法检测htnfα/cho细胞的外源性htnfα基因的表达;采用elisa法测定不同传代数的htnfα/cho细胞的培养上清液中htnfα蛋白的含量。在倒置光学显微镜下,观察培养中的htnfα/cho细胞、cho细胞的生长状态,并用mtt法测定该2种细胞的生长曲线,对比转染前、后htnfα/cho细胞与cho细胞生长增殖的变化。2、观察apa-htnfα/cho细胞微囊对共培养的肿瘤细胞生长的影响:分别用apa微囊包裹htnfα/cho细胞、0/cho细胞(转染空载体的cho细胞),用倒置光学显微镜观察体外培养的apa-htnfα/cho细胞微囊、apa-0/cho细胞微囊的形态变化及囊内细胞的生长状态。将定量的apa-htnfα/cho细胞微囊分别与9种不同的人肿瘤细胞(肝癌细胞hepg2、结肠癌细胞lovo、宫颈癌细胞hela、肺癌细胞h460、乳腺癌细胞mcf-7、膀胱癌细胞t24、乳腺癌细胞t47d、肺腺癌细胞a549、肾癌细胞achn)共培养。按照培养肿瘤细胞的加入物的不同分组:不加任何处理因素、仅培养的肿瘤细胞为空白对照组;加入htnfα溶液为阳性对照组;加入apa-0/cho细胞微囊为阴性对照组;加入不同剂量(低剂量50个、中剂量100个、高剂量200个细胞微囊)apa-htnfα/cho细胞微囊为实验组。采用mtt法检测各组肿瘤细胞三天的增殖值,计算并绘制增殖曲线,了解apa-htnfα/cho细胞微囊分别对9种不同的人肿瘤细胞生长的影响。应用spss19.0软件对实验数据进行重复测量资料的方差分析,按照α=0.05水平,p<0.05表示有明显统计学差异,p<0.01表示有显著统计学差异。3、观察apa-htnfα/cho细胞微囊植入对荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞生长的影响:参考上述体外实验结果,选取2种人肿瘤细胞,分别制备出移植瘤模型荷瘤裸鼠。分别将apa-htnfα/cho细胞微囊注射植入成模的荷瘤裸鼠肿瘤组织的内部及周围。按照给荷瘤裸鼠肿瘤组织中注射物的不同分组:注射生理盐水的为空白对照组;注射htnfα溶液的为阳性对照组;注射apa-0/cho细胞微囊的为阴性对照组;注射不同剂量的apa-htnfα/cho细胞微囊为实验组,并依剂量分为高、中、低剂量组。植入后每隔3天观察荷瘤裸鼠的生存状态,称重荷瘤裸鼠的体重,测量其肿瘤组织的长短径。于植入细胞微囊后第21天时测量结束后,用脊髓脱臼法处死荷瘤裸鼠,分离出荷瘤裸鼠的肿瘤组织,称重其瘤组织重量,测量其肿瘤组织的长短径。对数据进行整理计算。应用spss19.0软件对实验数据进行重复测量资料的方差分析,按照α=0.05水平,p<0.05表示有统计学差异,p<0.01表示有显著统计学差异。四、实验结果:1、htnfα/cho基因工程细胞的构建及其htnfα蛋白分泌功能的检定:pcr检测结果表明重组质粒中包含有htnfα基因;阳性克隆基因与htnfα基因测序比对结果表明整合的htnfα基因完整一致。rt-pcr检测结果显示:阳性对照基因gapdh电泳条带显示正常,表明整个rt-pcr检测体系正常;从5个转化株中筛选出4株含有htnfα基因,其中1号和2号的htnfα基因电泳条带呈强阳性,选用1号htnfα/cho细胞进行后续实验。光镜下观察和细胞生长曲线表明cho细胞转染前后生长未出现明显变化。2、apa-htnfα/cho细胞微囊对体外共培养的肿瘤细胞生长的抑制效应:⑴倒置光学显微镜下见apa-htnfα/cho细胞微囊呈圆球状,htnfα/cho细胞在囊内均一分布,培养3天后可见囊内细胞聚集成团。⑵与空白对照组比较,apa-0/cho细胞微囊组对9种肿瘤细胞的生长无明显抑制作用(p>0.05);阳性药物htnfα组对除t47d和hela外的7种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用(p<0.01);对t47d和hela细胞无抑制作用(p>0.05)。⑶与空白对照组比较,各剂量apa-htnfα/cho细胞微囊对除t47d和hela外的7种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用(p<0.01);中剂量该细胞微囊组对t47d细胞的生长具有抑制作用(p<0.05),高剂量该细胞微囊组对t47d和hela细胞的生长具有显著的抑制作用(p<0.01);大部分剂量的该细胞微囊抑制效果强于阳性药物htnfα组(p<0.05);部分存在剂量依赖关系。3、apa-htnfα/cho细胞微囊植入对裸鼠移植瘤生长的抑制效应⑴对荷lovo细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用植入apa-htnfα/cho细胞微囊对荷人结肠癌细胞lovo裸鼠的体重没有影响(p>0.05),21天后裸鼠均存活。21天时,与空白对照组比较,阳性药物htnfα组和高剂量apa-htnfα/cho细胞微囊组对瘤重量有明显的抑制作用(p<0.05)。高中低三个剂量apa-htnfα/cho细胞微囊组对人结肠癌lovo裸鼠移植瘤的瘤体积抑制率分别为31.9%、29.1%和14.7%;瘤重抑制率分别为54.8%、46.2%和29.9%。并可见阳性药物htnfα组的瘤体积抑制率为48.9%,瘤重抑制率为63.5%。而apa-0/cho细胞微囊组的瘤体积抑制率为-21.8%,瘤重抑制率为3.1%,无抑制肿瘤生长的作用。⑵对荷hepg2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用植入APA-hTNFα/CHO细胞微囊对荷人肝癌细胞HEPG2裸鼠的体重没有影响(P>0.05),21天后裸鼠均存活。21天时,与空白对照组比较,各剂量APA-hTNFα/CHO细胞微囊组对瘤组织无明显的抑制作用(P>0.05);高、中、低三个剂量组对人肝癌细胞HEPG2裸鼠移植瘤的瘤体积抑制率分别为14.6%、7.9%和-7.6%;瘤重抑制率分别为7.5%、3.2%和-12.7%。并可见阳性药物hTNFα组的瘤体积抑制率为45.3%,瘤重抑制率为45.4%。而APA-0/CHO细胞微囊组的瘤体积抑制率为-35.6%,瘤重抑制率为-32.2%,无抑制肿瘤生长的作用。五、结论1、成功的构建了hTNFα/CHO细胞系,该细胞能够较为稳定地遗传外源性hTNFα基因,并且能够通过增殖代谢将其翻译表达并释放出细胞外。选用1号筛选株的第五代细胞进行下一步实验。2、APA-hTNFα/CHO细胞微囊对共培养的9种肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用,部分实验中抑制效应存在明确的剂量依赖关系。APA微囊中的hTNFα/CHO细胞可通过分泌释放hTNFα至培养液中,产生抑制这些肿瘤细胞生长的作用。选用的HEPG2和LOVO细胞进行下一步实验。3、APA-hTNFα/CHO细胞微囊对荷人结肠癌细胞LOVO具有明显的抑制瘤组织生长的作用;对荷HEPG2细胞裸鼠的瘤组织生长具有一定的抑制趋势;对荷瘤裸鼠的生存没有明显的影响。提示APA-hTNFα/CHO细胞微囊中的hTNFα/CHO细胞可通过分泌释放hTNFα至肿瘤组织中,发挥抑制肿瘤组织细胞生长的作用,特别是对荷LOVO细胞裸鼠。本研究构建了hTNFα/CHO细胞系,在APA微囊的包裹下,通过体内、外实验证明其具有抑制多种肿瘤组织细胞生长的作用。进一步表明APA-hTNFα/X细胞微囊有望成为治疗恶性肿瘤的全新的细胞治疗产品,他可克服异基因载体细胞的免疫排斥反应问题,可解决hTNFα临床应用的难题,以基因工程活细胞产生持续分泌hTNFα的微型生物泵作用,达到维持肿瘤组织局部高浓度hTNFα、全身其他组织低浓度hTNFα的效应,可更好地发挥hTNFα的抑瘤作用,并降低全身不良反应。可望为难治的恶性肿瘤提供全新有效的辅助治疗手段。