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背景:在哺乳动物胚胎发育过程中,造血发生可分为起始于卵黄囊(Yolk sac)的原始造血(primitive hematopoiesis)和起源于 AGM(aorta/gonad/mesonephros,AGM)区域的成体造血(definitive hematopoiesis)。造血发生机制的研究对于了解人类造血过程和相关临床应用具有重要意义。人类胚胎干细胞培养技术和成体细胞重编程技术的发明使人类多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC),包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC)成为体外培养系统的重要起始细胞来源。近年来,体外共培养血细胞分化方法的研究取得了显著进展,可以从hESC/hiPSC获得大量红细胞和其他类型的血细胞。这些系统不仅为体外产生血细胞提供了可能,而且为研究造血分化过程的分子调控机制提供了良好的模型。人类RUNX1基因,位于染色体21q22.3,全长261 kb,有远端启动子P1和近端启动子P2,是人类造血发生的关键调控基因(尤其是成体造血)。RUNX1有多种剪接异构体,如RUNX1a、RUNX1b、RUNX1c和RUNX1-205等。本实验室已构建RUN1b诱导过表达hES细胞系,发现早期诱导RUN1b过表达阻碍了造血发生过程,这种抑制现象可以被TGF-β信号通路的抑制剂RepSox所部分拯救,诱导RUNX1b过表达阻碍人类造血的分子机制有待进一步探索。RUNX1-205是RUNX1的一种特殊而且很少被研究的异构体,除了RUNX1a/b/c,RUNX1-20 是由完整编码区编码的最长蛋白,与RUNX1b相比,RUNX1-205仅缺失6号外显子。RUNX1-205在小鼠中的同源基因Runx1-202,对小鼠造血功能具有复杂的作用,推测RUNX1-205可能在人类造血发生中也起到重要作用,但迄今尚未在人体外造血系统中进行研究。因此探索人类RUNX1基因不同异构体调控造血发生的分子机制具有非常重要的意义。血液循环紊乱或阻塞在中医中被称为血瘀症(blood stasis syndrome,BSS),可能是由障碍性贫血、血液循环或微循环异常、血管内皮损伤和血液成分变化所引起。活血中药如鸡血藤可以改善造血,从而有效治疗BSS疾病。我们尝试利用AGM-S3共培养系统对鸡血藤单体化合物进行研究,阐明其有效性的细胞或分子机制。第1页方法:本研究基于转座子载体PiggyBac的PB-tet-on-OE诱导过表达系统以及hESC与AGM-S3基质细胞共培养体外造血体系。使用细胞生物学方法,例如:流式细胞荧光分选技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)、造血集落培养(Hematopoietic Colony Assay)、麦格氏-姬姆萨染色(May-Grunwald-Giemsa Staining,MGG)、拟胚体形成培养(embryoid body formation,EBs);分子生物学方法,例如蛋白免疫印记(Western Blot,WB)、实时荧光定量 PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)等技术,以探究RUNX1异构体(RUNX1b及RUNX1-205)在造血发生过程中的细胞分子机制,同时探究4种鸡血藤单体化合物以不同浓度梯度在共培养不同时期作用于hESC与AGM-S3基质细胞共培养体系,对成体造血和红系发生产生的影响。结果:1、建立了基于 H1 hESC 的诱导过表达CDKN2B(P15)CDKN2B(P15)、CDKN1A(P21)hES细胞系,过表达细胞系依旧保持多能干性。早期诱导RUNX1b过表达与TGF-β信号通路上调产生的造血阻滞效应与细胞周期状态改变相关(G1期阻滞),细胞周期相关基因P15、P18、P21的表达量随着诱导RUNX1b过表达而显著上调,而在同时添加RepSox时则基本恢复正常,从DO使用不同剂量DOX诱导RUNX1b过表达,D4检测发现RUNX1b与这三个基因在转录水平上呈现正相关关系。DO诱导P15、P18、P21基因过表达以及DO向RUNX1b/hESC与AGM-S3共培养中直接添加TGF-β1,都阻碍了 CD34+CD43+和CD34+CD45+细胞群的产生,表现出严重的造血阻滞,但不明显影响CD34单阳细胞群的产生。2、建立了基于H1 hESC的诱导过表达RUNX1-205hES细胞系,过表达细胞系依旧保持多能干性。通过对RUNX1在进化过程中物种的氨基酸序列同源比对分析发现RUNX1-205在进化上高度保守。在RUNX1-205/hESC与AGM-S3共培养中,D0-D2诱导RUNX1-205过表达会产生造血阻滞现象,而当诱导开始晚于D6时抑制效应变弱或甚至消失。无论是共培养体系还是EBs形成体系中,早期诱导RUNX1-205过表达下调造血发生相关基因的表达。DO诱导RUNX1-205过表达的D14共培养细胞经过造血集落培养产生的CFU-E、BFU-E、CFU-Mix和CFU-GM克隆数降低,而D6诱导时产生的克隆数都恢复到正常水平。转基因293T细胞中,RUNX1-205蛋白比RUNX1b稳定。在H1 hESC与AGM-S3共培养过程中,RUNX1-205的转录表达水平在早期(D2-D4)相对较高,而在晚期(D4之后)低得多,而RUNX1b在早期(D2-D4)较高,在D6下降至最低点并且在晚期(D8之后)逐渐上升。3、在D12将儿茶素加入共培养体系至10 μM的终浓度能够有效刺激成体造血及红系发生。其中相较于对照组(加入等体积DMSO),第14天检测CD34+CD45+细胞群扩增2.5倍(P<0.0001),GPA+CD71+细胞群扩增1.5倍(P<0.0001);在相同条件下,儿茶素对共培养细胞的刺激能使其在造血集落培养中产生更多的CFU-E、BFU-E、CFU-Mix、CFU-GM克隆;同时,qRT-PCR显示造血及红系相关基因高表达。结论与意义:1、过表达RUNX1b可能增强TGF-β信号通路,然后上调P15、P18、P21的表达造成细胞周期G1期阻滞,进而产生造血阻滞的现象。在造血早期阶段诱导P15、P18、P21过表达或上调TGF-β信号通路,都会产生与诱导RUNX1过表达相似的阻碍造血的效应,特别是显著下调了 CD34+CD43+细胞群及CD34+CD45+细胞群的产生,但不明显影响CD34单阳细胞群的产生。2、早期(特别是DO)诱导RUNX1-205过表达对中胚层发育无明显影响,但抑制了 CD34+及其后续成体造血相关亚群CD34+CD43+和CD34+CD45+的产生,同时也下调了许多重要造血发生相关基因的表达,而当晚期诱导(晚于D6)时抑制效果变弱或甚至消失,该现象与诱导RUNX1b过表达类似。但RUNX1-205与RUNX1b在蛋白稳定性及造血发生过程中的转录表达谱有较大差异。由以上结果推测RUNX1-205可能与RUNX21b具有相似的功能,并可能起到功能互补作用。3、流式分析,造血集落形成实验和后续的qRT-PCR检测发现仅在造血晚期适宜浓度的儿茶素对成体造血和红系发生有刺激作用,提示hESC与AGM-S3共培养体系可作为筛选具有促进造血功效的中药活性成分的有效检测手段,在临床和制药工业中具有潜在的应用前景。