鲢鱼肌原纤维蛋白糖基化改性复合物的理化、功能特性与构效关系研究

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本课题将魔芋葡甘露低聚糖(KOG),葡萄糖和麦芽糊精分别与肌原纤维蛋白,在温度50oC和湿度75%条件下进行糖基化反应,制备反应时间段为0,2,5,8,12,24,48,72,96 h的糖蛋白,测定糖基化产物(MRPs)的理化性质和功能特性,以及建立结构-功能模型,主要研究内容及结果如下:(1)随着糖基化反应的进行,SDS-PAGE图谱中,蛋白条带上移;取代度升高,在96 h后,Mf-KOG,Mf-mal和Mf-glu的取代度分别达到110μg/mg,105μg/mg和22μg/mg;有效氨基酸含量下降至52%,49%和40%。表明糖成功地连接到了蛋白质上,且葡萄糖与肌原纤维蛋白反应的速度比多糖更快。同时,随着糖基化反应的进行,三种糖基化产物的表观粘度都有所上升,等电点有所下降,表明糖基化反应改变了肌原纤维蛋白的表面性质和构象。(2)随着糖基化反应的进程,肌原纤维蛋白发生变性,Ca2+-ATP酶活性和巯基含量下降。反应前期,糖基化作用对蛋白质的影响高于热变性的影响;反应中后期,热变性起到主导作用。多糖对蛋白质在糖基化过程中有较好的保护作用,Mf-mal和Mf-KOG的Ca2+-ATP酶活性和巯基含量普遍比Mf-glu糖基化产物的要高。(3)随着糖基化反应的进程,Mf-KOG,Mf-mal和Mf-glu的变性峰值温度分别从64oC上升到86oC,从62oC上升到85oC,从60oC上升到78oC。Mf-KOG,Mf-mal和Mf-glu的表面疏水性分别从40μg下降到18μg,从42μg下降到32μg,从43μg下降到30μg。表明糖基化反应打开了蛋白质的结构,引起蛋白质构象的变化。(4)在低盐浓度溶液中,随着糖基化反应的进行,肌原纤维蛋白的溶解度有所提升。其中,葡萄糖和KOG对肌原纤维蛋白的溶解度提升比麦芽糊精要好。而在高盐离子溶液中,三种糖基化产物的溶解度都下降。糖基化产物的热稳定性在反应的2-5 h下降,之后逐步提升,最高能达到80-90%,且Mf-KOG和Mf-mal的热稳定性比Mf-glu的要好。随着糖基化反应的进程,糖基化产物的乳化性和起泡特性逐渐提高,在8-12 h达到最大值,随后下降。Mf-KOG和Mf-mal的乳化性和起泡特性比Mf-glu总体上要好一些,表明控制糖基化时间保持在反应初期是非常重要的。此外,多糖更有助于提升蛋白质的热稳定性、乳化性、起泡性,单糖更有助于提升溶解度。KOG对肌原纤维蛋白的各功能特性提升效果较好,是一种新型的优良糖供体。(5)随着反应时间的延长,糖基化产物的抗氧化能力得到了较好地提高。其中,Mf-KOG对DPPH·自由基的清除率效果最好,从22%上升至64%;Mf-glu对·OH自由基的清除率效果最好,从78%上升至94%;Mf-glu的还原能力最好,超过了1 mg/mL的Vc的还原能力(2.1);Mf-glu的抗脂质过氧化能力最好,从28%上升至49%。综上所述,单糖对肌原纤维蛋白抗氧化作用的改性效果更好。(6)在体外消化过程中,糖基化反应时间越长,116 kDa和36-45 kDa的条带降解越多,表明糖基化反应加快了肌原纤维蛋白的体外消化。此外,Mf-KOG最耐消化,表明多糖具有耐消化性。(7)本课题根据糖基化产物的结构-功能模型,探讨糖基化产物的理化性质对功能特性的影响。Mf-KOG糖基化产物中,对溶解度、乳化活性、乳化稳定性和起泡性影响最为显著的分别为取代度,表观粘度,取代度及取代度和表面疏水性。Mf-mal糖基化产物中,对溶解度、乳化活性影响最为显著的是等电点,对乳化稳定性和起泡性影响最为显著的是等电点和表观粘度。Mf-glu糖基化产物中,对溶解度、乳化活性、乳化稳定性和起泡性的影响最为显著的是表面疏水性,电点和表面疏水性,取代度及等电点和表观粘度。本课题通过糖基化反应,显著地提高了肌原纤维蛋白的功能特性,补充和完善了糖基化反应的理论基础,为蛋白的实际应用提供理论依据。
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