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目的:多氯联苯(Polychlorinated biphenyl，PCB)作为环境内分泌干扰物的典型代表，是一类广泛应用到日常生活中的持久性环境有机污染物。能通过空气、水-、食物等多种途径侵入人体，给人类健康造成危害，由该类有机污染物带来的健康危害已引起了世界各国学者的广泛关注。近年来，在PCB的毒性效应研究中，其对生殖系统、神经系统、内分泌系统的损害日益受到重视，并且尤以其对男性生殖功能的影响为焦点。现已有文献报道，PCB暴露可能导致睾丸重量和精子数量减少，在人类流行病学研究中也发现样本血清中的PCBs含量和睾酮水平之间呈现负相关。然而，PCBs影响精子发生的具体作用机制目前还未被完全阐明。 血睾屏障(blood-testis barrier，BTB)位于曲细精管和毛细血管之间，是生精上皮中以Sertoli细胞(Sertoli cell，SC)间的紧密连接为基础形成的结构。该结构是既作为一道有效的免疫屏障，使各期精细胞的发育在相对独立的小室内进行，避免精子抗体的产生，还避免了血液循环中的有害物质对生精过程产生影响，保障了精子发生的顺利进行。因此，该结构对雄性生殖功能具有重要的意义。 围绕上述问题，本课题选取PCB混合物Aroclor1254对雄性SD成年大鼠及体外原代培养的Sertoli细胞进行染毒，评估BTB结构及其功能的变化。通过分析BTB相关连接蛋白的表达及定位的改变，寻找Aroclor1254毒性作用的靶分子，从而揭示该化合物对BTB结构及其功能影响的分子机制，期待为有机环境污染物的生殖毒理学研究和该类化合物对人类生殖风险的评估以及不孕不育的预防提供实验依据。 研究方法:1.本研究体内实验选取成年90d雄性SD大鼠(250-300 g)为研究对象，腹腔注射Aroclor1254（1、3 mg/kg）或Aroclor1254(3 mg/kg)与p38 MAPK抑制剂SB203580(10μM)的混合物后，进行:①生物素标记的体内BTB屏障功能检测;②制备睾丸组织冰冻切片，免疫荧光观察BTB相关连接蛋白分布的变化;③免疫印迹检测BTB相关连接蛋白水平。2.体外实验原代培养20d雄性SD大鼠Sertoli细胞，培养后第3d用Aroclor1254(0-100μg/ml)处理，于不同时间点:①测定细胞活力筛选最佳染毒浓度;②测定跨内皮电阻(TER)值及荧光素钠(Na-F)渗透率反映Sertoli细胞屏障功能;③免疫印迹检测Sertoli细胞连接蛋白水平;④免疫荧光观察Sertoli细胞连接蛋白分布;3.Caveolin依赖的胞内转运抑制剂胆固醇氧化酶(CO)与Aroclor1254联合处理Sertoli细胞后，检测以上体外指标变化(②-④)。4.泛素蛋白连接酶Itch siRNA沉默与Aroclor1254联合处理Sertoli细胞后，检测以上体外指标变化(②-④)。 结果:1.Aroclor1254通过p38 MAPK途径破坏大鼠体内BTB屏障功能。体内BTB功能检测实验观察到Aroclor1254处理后生物素自生精小管基底膜向管腔的弥散距离与对照组相比明显增大，而在Arclor1254+SB203580处理组，该弥散距离与Arclor1254组相比显著降低;免疫荧光检测结果显示，Aroclor1254处理后BTB相关连接蛋白occludin的荧光信号与对照组相比减弱，JAM-A、N-cadherin信号分散不集中，而Arclor1254+SB203580组不存在该现象;免疫印迹结果显示，Aroclor1254处理组occludin表达量与对照组相比显著降低同时p38 MAPK磷酸化增多，其他连接蛋白表达水平无显著变化，Arclor1254+SB203580组occludin表达量无明显改变。2.Aroclor1254通过p38 MAPK途径影响体外Sertoli细胞上皮屏障功能。细胞活力实验结果显示，Aroclor1254在10μg/ml浓度下对Sertoli细胞无显著毒性作用，即对其存活率无明显影响;TER及Na-F渗透率测定结果显示，Aroclor1254处理后SC屏障功能显著下降;免疫印迹发现Arolcor1254处理后occludin水平降低，p38磷酸化水平升高，同时胞内转运功能蛋白caveolin-1的水平增高;免疫荧光实验观察到与对照组相比，Aroclor1254处理组BTB连接蛋白occludin信号减弱，N-cadherin、β-catenin信号分散不集中于细胞连接处。Aroclor1254+SB253580组与对照组相比无以上变化，即SB253580可以拮抗Aroclor1254对BTB的影响。3.Aroclor1254-p38MAPK通过Caveolae依赖的连接蛋白胞内转运影响体外BTB屏障功能。TER及Na-F渗透率测定结果显示，CO处理可部分拮抗Aroclor1254引起的体外屏障功能下降;免疫印迹结果显示CO处理对Aroclor1254引起的occludin水平降低无影响;免疫荧光可见CO处理后Aroclor1254不能引起N-cadherin、β-catenin的定位变化。4.Aroclor1254-p38 MAPK通过泛素连接酶Itch下调occludin蛋白水平影响体外BTB屏障功能。免疫印迹显示Itch沉默后，Aroclor1254不能引起occludin水平降低;TER及Na-F渗透率测定结果显示，Itch沉默可部分拮抗Aroclor1254引起的体外屏障功能下降;免疫荧光可见Itch沉默后Aroclor1254不能引起occludin的定位变化。 结论:Aroclor1254通过p38 MAPK途径促进caveolae依赖的连接蛋白胞内转运及Itch介导的occludin泛素化降解影响BTB屏障功能。