microRNA-134在小细胞肺癌中的耐药机制及其光电化学检测

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本文通过对光电化学生物传感器的研究进行文献综述,提出以新型的TiO2纳米花为电极材料并进行修饰,利用DNA探针与microRNA-134(miR-134)碱基互补配对之间的反应,构建新型的光电化学生物传感器,并实现了对microRNA-134的定量分析检测。具体研究内容如下:  1.miR-134在小细胞肺癌中的耐药机制研究  采用基因芯片预测了miR-134分别在敏感细胞株和耐药细胞株中的表达量,并用实时荧光定量PCR验证芯片结果。用miR-134类似物和抑制剂增加或降低小细胞肺癌多药耐药细胞株H69AR和敏感细胞株H69中miR-134的表达水平,CCK8法分析两株细胞对小细胞肺癌常用化疗药物敏感性的变化,流式细胞术分析细胞凋亡和周期的变化,构建荧光素酶载体与miR-134类似物或抑制剂共转染H69和H69AR细胞,双荧光素酶报告基因测定方法检测MYCN荧光素酶活性,实时荧光定量PCR验证转染后抑癌基因NDRG4以及MYCN的表达情况,并用WesternBlot技术分析NDRG4以及MYCN蛋白水平的变化,提示miR-134调控小细胞肺癌(SCLC)多药耐药的发生是通过NDRG4间接调控MYCN的。进一步用裸鼠皮下成瘤实验进行验证。得到结论miR-134是SCLC多药耐药治疗的靶点。  2.基于TiO2NFs光电化学生物传感器的研究  采用水热法在FTO电极表面合成TiO2纳米花,再在其表面连接茎环结构DNA S1,通过DNA碱基互补配对反应连接microRNA,再接入末端修饰醛基的探针DNA S2,通过醛基氧化还原反应发生光电流变化间接测定microRNA的浓度。采用扫描电子显微镜、X射线衍射对TiO2NFs进行一系列的表征,并对该传感器的波长、偏压、pH、孵育时间等条件进行了优化,成功地构建出新型的DNAS1/AuNPs/TiO2NFs光电化学生物传感器,实现对小细胞肺癌细胞总RNA提取液中miR-134的检测。实验结果表明DNA S1/AuNPs/TiO2NFs/FTO光电化学生物传感器具有检测方法简单,检出限低,灵敏度高,具有良好的选择性和稳定性等优点。实验证明该传感器有望用于临床人体样品RNA提取液的检测,其中,检出限为33.25 pmol/mL。用于细胞RNA总提取液中miR-134的检测,实验结果与RT-PCR结果相近,有望应用于临床上对肿瘤标志物的检测。
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