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虽然显微外科技术的发展极大地提高了周围神经缺损修复的质量,但修复效果仍不令人满意。尤其是严重创伤、肿瘤切除以及先天性畸形等原因引起的周围神经缺损,其修复与重建仍是临床上治疗的难点。自体神经移植是目前临床上首选的神经重建方法,但由于供体神经缺乏、修复长度有限、供体区域功能丧失、神经瘤和自发神经痛等问题,其临床应用受到很大限制。近些年来,随着合成材料学、生物工程学等学科的不断进展,组织工程化人工神经给人们带来新的期望。嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是一种特殊类型的胶质细胞,具有很强的促进轴突再生和形成髓鞘的能力。聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly(DL-lactide-co -glycolide),PLGA)是一种生物可降解性合成材料,具有来源丰富、组织相容性好、可塑性强等优点,被认为是一种较为理想的人工神经支架材料。基于上述背景,本实验采用急性分离的OECs复合PLGA导管,伍用细胞外基质凝胶修复大鼠坐骨神经缺损,旨在寻找修复周围神经缺损的可行方法,并丰富周围神经缺损的修复理论。本实验第一部分采用改良的Sasaki(2004年)方法,嗅神经层和颗粒层取材、分离和培养OECs,培养3d后用NGFRp75、S-100进行免疫荧光鉴定,以确定OECs的纯度。第二部分将急性分离的OECs接种于PLGA膜上,通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察OECs在PLGA膜上粘附、生长情况;MTT、流式细胞术等方法测定OECs接种于PLGA膜后细胞增殖和细胞周期的变化情况,以探讨PLGA与OECs的细胞相容性。第三部分建立10mm的大鼠右侧坐骨神经缺损模型,用CM-DiI标记的OECs复合PLGA导管进行修复,同时设OECs+硅胶管组,PLGA组和硅胶管组为对照,在术后8w的时间内进行细胞示踪、再生神经功能学评价和组织学评价、靶组织功能评价、逆行示踪和脊髓前角细胞计数等检测,从而探讨OECs复合PLGA导管对坐骨神经再生及靶组织功能恢复的促进作用和对上位运动神经元的保护作用。所取得的主要结果如下:1.倒置显微镜下,OECs立体感强,胞体清晰,呈双极或多极,突起细长。NGFRp75和S-100免疫荧光鉴定双阳性。急性分离的OECs纯度为50%～60%。2. PLGA组OECs形态特征与对照组无明显差异。MTT检测证实PLGA对OECs的代谢活动无显著影响(直接细胞毒性实验评价为1级)。PLGA组OECs的细胞周期与对照组无显著差异,其DNA指数在正常范围内(1.0±0.1),OECs为正常二倍体细胞,PLGA对OECs无致癌作用,二者联合应用对机体无害。3. CM-DiI标记的OECs存活时间可达6w,移植细胞沿神经纵轴分布,PLGA导管内OECs的存活时间长于硅胶管。4.术后8w时,OECs+PLGA组足跟部溃疡愈合率为83.3%,再生神经相对直径恢复率为58.0±2.9%,无自食现象,一般情况明显优于其它三组。桥接的PLGA导管具有光滑的神经样外表,与周围组织无明显粘连,表面有少量浅表血供形成;而硅胶管表面有一层结缔组织膜形成,表面无血供形成。5.术后6w时,OECs+PLGA组首先出现感觉功能的改善,其平均回缩时间为3.05±0.11sec,明显短于同期其它三组(P<0.05)。术后8w时,OECs+PLGA组感觉功能继续好转,OECs+硅胶管组回缩时间也减至3.06±0.09sec,与PLGA组和硅胶管组差异显著(P<0.05)。各组的坐骨神经功能指数在8w的观测时间内,均无明显改善。OECs+PLGA组动作电位的潜伏期最短( 3.10±0.11ms ),其神经传导速度为19.38±0.70m/s,与其它三组差异显著(P<0.05)。OECs+PLGA组复合肌肉动作电位的波幅为3.21±0.47mV,也远高于其它三组(P<0.01)。6.术后8w时,OECs+PLGA组腓肠肌湿重恢复率为67.22±4.46%,显著高于其它三组。同时,OECs+ PLGA组的运动终板单位数量最接近于正常,为55.5±3.7个,体积在四组中最大,长轴为41.5±8.8μm,短轴为22.5±3.8μm,也显著优于其它三组(P<0.05)。7.术后8w时,各组逆行示踪检测均有阳性神经元发现。OECs+PLGA组实验侧与对照侧阳性神经元个数百分比为77.1±3.0%,与OECs+硅胶管组相比无显著差异(P>0.05),但与PLGA组和硅胶管组差异显著(P<0.05)。同时,OECs+PLGA组与OECs+硅胶管组的术侧脊髓前角外侧群大、中型运动神经元数量分别为9.2±0.8个和9.2±0.4个,明显高于无细胞移植的两组(P<0.05)。8.术后8w时,再生神经甲苯胺兰染色计量结果示OECs+PLGA组再生神经中段水平有髓神经纤维密度为17713±2505/mm2,明显高于其它三组(P<0.05)。OECs+PLGA组的再生神经中段总神经纤维数为6627±1032,与OECs+硅胶管组无明显差异(P>0.05),但明显优于无细胞移植的两组(P<0.05)。再生神经远段水平OECs+PLGA组和OECs+硅胶管组的上述两项指标显著优于PLGA组和硅胶管组(P<0.05)。透射电镜显示再生神经中段水平OECs+ PLGA组有髓纤维的成熟度最高,无髓纤维数量最少,OECs+硅胶管组成熟度次之,PLGA组和硅胶管组最低。各组再生神经远段水平透射电镜观察结果与中段相似。以上结果表明:1. PLGA对OECs的形态特征、增殖能力、细胞周期及倍体水平无显著影响,PLGA与OECs具有良好的生物相容性,适于构建组织工程化人工神经。2. CM-DiI标记的OECs移植后能够在桥接管内存活,PLGA导管有利于体内移植细胞的存活。3. OECs与PLGA联合应用能够促进腓肠肌湿重的恢复,促进运动终板功能的重建,两者的联合应用有利于再生神经对靶组织的再支配。4. OECs能够促进再生神经纤维与神经元的再连接,增加脊髓前角外侧群大、中型运动神经元的存活数量。5. OECs复合PLGA能够促进坐骨神经感觉功能和电生理功能的恢复,促进轴突再生和髓鞘形成。