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肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(以下简称肝癌)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,在全球,肝癌的发病率不断攀升。流行病学和实验研究均表明病毒性肝炎与原发性肝癌的发生有着特定的关系,其中以乙型肝炎与肝癌关系最为密切。中国肝癌患者中约90%都存在乙型肝炎病毒(HBV)感染背景,加上其恶性程度高和预后差等特点,我国面临的肝癌形势日益严峻。截至目前,传统外科手术和肝移植依然是肝癌治疗的最佳方案,但由于肝癌起病隐匿,特异性临床表现缺乏,大多数病人就诊时已错过最佳的手术时机,预后极差。因此,为探索肝癌发生发展、侵袭转移的机制,改善患者长期预后,针对肝癌相关分子的研究已成为当前的研究热点。HACE1基因是属于HECT家族的E3泛素连接酶(HECT E3),位于染色体6q21,是多种恶性肿瘤中频繁发生突变的一个位点。HACE1基因最早发现与肾母细胞瘤的发生发展密切相关,进一步研究发现该基因的低表达或突变与人类多种恶性肿瘤相关,如乳腺癌,结直肠癌和淋巴瘤等。目前,HACE1基因对肝癌的作用未有明确报道。因此,本实验主要探讨HACE1基因在肝癌细胞中的生物学特性,研究其对肝癌发生发展、侵袭转移的作用及其与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。第一部分HACE1基因在肝癌细胞系和肝癌组织中的表达研究目的:研究HACE1基因在肝癌细胞株Huh7,MHCC97H,HCCLM3,MHCC97L,HepG2,SMCC7721以及肝正常细胞株L02和肝癌组织及相应癌旁组织中的表达,初步探讨其与肝癌发生的关系。方法:采用RT?PCR和western blot方法检测HACE1基因在肝癌细胞系、肝正常细胞株L02和40组肝癌及其相应癌旁组织中mRNA和蛋白的表达水平。结果:在不同的肝癌细胞株Huh7,MHCC97H,HCCLM3,MHCC97L,HepG2,SMCC7721中,HACE1基因表达水平明显低于肝正常细胞株L02,其中Huh7细胞中的HACE1基因相对表达水平最高,SMCC7721细胞中HACE1基因相对表达水平最低,因此选择这两株细胞进行后续功能实验;在肝癌及相应癌旁组织中,HACE1在肝癌中的表达明显低于癌旁组织。结论:HACE1是一种重要的肿瘤抑制基因,其突变对肝癌的发生具有重要作用。第二部分HACE1基因表达水平与肝癌细胞增殖与迁移的关系目的:探讨HACE1基因对Huh7和SMCC7721肝癌细胞株增殖与迁移的作用。方法:通过转染HACE1 siRNA脂质体与pcDNA3.1-HACE1质粒分别沉默和过表达Huh7与SMCC7721细胞中的HACE1基因,从而构建稳定转染HACE1siRNA、pcDNA3.1-HACE1的Huh7和SMCC7721肝癌细胞株;RT?PCR和western blot检测HACE1基因的沉默和过表达效率;CCK-8实验检测沉默或过表达HACE1基因对肝癌细胞增殖能力影响;Transwell和细胞划痕实验检测对肝癌细胞迁移能力的作用。结果:成功建立稳定转染HACE1 siRNA和pcDNA3.1-HACE1的Huh7和SMCC7721细胞株;CCK-8、Transwell和细胞划痕实验表明HACE1基因表达下调能够明显促进Huh7细胞的增殖和迁移(P<0.01);过表达HACE1基因能够明显抑制SMCC7721细胞的增殖和迁移能力(P<0.05)。结论:HACE1基因与肝癌的发生发展和侵袭转移有关。第三部分HACE1基因表达与肝癌患者临床病理特征及预后的关系目的:探讨HACE1基因在肝癌组织中的表达差异与肝癌临床病理特征及预后的关系。方法:采用免疫组化方法检测102例肝癌组织中HACE1基因的表达情况,探讨HACE1基因的不同表达水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。结果:在所有102例患者中,其中75例患者HACE1基因呈低表达,27例患者HACE1基因呈高表达,且HACE1基因低表达的肝癌患者其肿瘤恶性程度更高。肝癌组织中HACE1基因表达水平的高低与患者血清AFP水平(P<0.001),肿瘤分期(P<0.05)和血管侵犯密切相关(P<0.05),且HACE1基因高表达的患者5年总体生存率明显高于低表达组(P<0.05)。单因素和多因素回归分析表明血清AFP水平、肿瘤分期和HACE1表达水平不仅能够影响肝癌患者的总体生存率,同时也是独立的预后因素。结论:HACE1基因在肝癌组织中的表达差异与肝癌的恶性程度和预后密切相关。