大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTB)能够与黏膜上皮细胞的神经节苷脂GM1受体结合,具有很强的免疫原性和免疫增强活性,是目前最受关注的黏膜免疫佐剂之一。在其从实验室走向产业化生产的过程中,重组LTB蛋白获得高效表达和通过生物安全性评价是其关键研发环节。本研究利用自动发酵罐培养重组毕赤酵母进行LTB表达。培养条件为温度30℃,pH 6.0,溶氧35%,氨水和2%蛋白胨为氮源,补入发酵液总体积1%的甲醇作为碳源。初始碳源消耗完后依据溶氧曲线的波动逐步增加甲醇的流加速度,使甲醇浓度维持在1.5%左右,诱导表达96 h,获得重组LTB的高效分泌表达。以硫酸铵沉淀和Ni2+螯合柱亲和层析等蛋白纯化方法,获得纯度高达98%的重组LTB蛋白。以变性和非变性十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证了重组LTB的五聚体结构；神经节苷脂GM1酶联免疫吸附(GM.1-ELISA)法检测结果表明,重组LTB具有与神经节苷脂GM1结合的生物活性。采用GM1-ELISA测定LTB注射后不同时间点鸭血清中的LTB含量来研究LTB在鸭血清中的消长动态。结果表明试验鸭血清中的LTB含量变化及维持时间与LTB注射剂量呈正相关。ELISA法检测鸭血清中免疫球蛋白、细胞因子和可溶性CD4和CD8的水平,以评价LTB对鸭的免疫功能的影响。结果表明,高剂量LTB显著提高IgG的水平(P<0.01),对IgA和IgM也有一定的提高作用；显著提高IL-6和IL-10水平(P<0.05),对TNF-α影响不显著(P>0.05)；试验鸭血清中的CD4含量增加显著(P<0.05),CD8含量有所下降,但不显著(P>0.05)。LTB的安全性研究包括对LTB蛋白编码基因和抗性标记基因的残留检测、过敏反应和诱导免疫反应以及对鸭的毒性作用研究。结果表明,纯化的重组LTB蛋白中未检测到LTB蛋白编码基因及抗性标记基因的残留,未引起试验鸭的过敏反应,但能诱导试验鸭产生与注射剂量呈正相关的抗LTB抗体水平。在连续3次肌肉注射LTB后观察临床症状和剖检病理变化,并采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑制备组织切片。HE染色切片观察显示50 mg/kg注射组肝细胞轻度浊肿变性,肺脏轻微炎症,100 mg/kg注射组肝细胞浊肿变性明显、肺脏重度炎症、脑组织出现局灶性坏死；免疫酶组织化学染色观察显示LTB在各组织器官中以大脑含量最高,脾脏和肝脏次之,心脏和肺脏检出量低。本研究结果明确了重组LTB的生物安全性和最高安全使用剂量,对进一步临床应用具有指导意义。