【摘 要】
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目的:以酰肼修饰明胶（Gelatin-ADH）和磺酸化醛基修饰透明质酸（HA-CHO-SO3）为基础构建一种新型复合水凝胶,并同时混合转化生长因子-β1（TGF-β1）和小分子药物Kartogenin（KGN）,用于协同促进软骨组织再生与修复。方法:分别将明胶,透明质酸和β-环糊精进行改性为酰肼修饰的明胶（Gelatin-ADH）,磺酸化醛基修饰的透明质酸（HA-CHO-SO3）和醛基的修饰β-环
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目的:以酰肼修饰明胶（Gelatin-ADH）和磺酸化醛基修饰透明质酸（HA-CHO-SO3）为基础构建一种新型复合水凝胶,并同时混合转化生长因子-β1（TGF-β1）和小分子药物Kartogenin（KGN）,用于协同促进软骨组织再生与修复。方法:分别将明胶,透明质酸和β-环糊精进行改性为酰肼修饰的明胶（Gelatin-ADH）,磺酸化醛基修饰的透明质酸（HA-CHO-SO3）和醛基的修饰β-环糊精（β-CD-CHO）,通过FTIR对修饰后的材料进行结构表征及流变检测。全骨髓法提取兔骨髓间充质干细胞（Rabbit Bone Marrow Stem Cells,r BMSCs）,分别制备空白对照组（Hydrogel组）、单独应用组（Hydrogel+KGN组、Hydrogel+TGFβ组）和联合应用组（Hydrogel+KGN+TGFβ组）四种不同类型水凝胶,观察不同分组条件下r BMSCs的成软骨效果。采用活死细胞染色和细胞骨架染色分别检测四组水凝胶生物相容性;为评估体外诱导r BMSCs向软骨分化的可行性,四组水凝胶体外培养4周后取材,采用Ⅱ型胶原免疫荧光染色及组织蛋白定量检测其软骨相关蛋白（SOX-9、ACAN和COLⅡ）表达情况;为评估水凝胶是否能在体内再生具有特定形状和适当力学强度的软骨组织,我们将负载r BMSCs四组水凝胶通过模具法塑形成圆柱状和管状形态并植入裸鼠体内培养,6周后取材进行检测,采用HE染色、Safranin-O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色评估再生软骨组织的软骨相关细胞外基质表达情况及表型;采用Western-blot测定各组再生软骨组织相关蛋白表达情况。最后优选联合应用组负载r BMSCs后再生出管状气管组织,并对兔气管缺损模型进行软骨缺损修复,12周后取材,进行大体观察及组织染色以评价其修复效果。结果:（1）FTIR结果显示明胶,透明质酸和β-环糊精均修饰成功。大体结果显示修饰后的明胶和透明质酸复合可以形成稳定的水凝胶。流变检测表明磺酸化及环糊精的加入不会改变水凝胶的力学性能,生理温度不会破坏水凝胶的稳定性。（2）活死细胞染色和细胞骨架染色表明水凝胶在成胶过程和细胞增殖过程中均具有良好的生物相容性,并且联合应用组r BMSCs表现出最均质的细胞分布,形态良好,且增殖数量最多。（3）体外培养4周后Ⅱ型胶原荧光染色显示联合应用组COL Ⅱ表达最多,蛋白定量测定结果显示联合应用组软骨特征基因和蛋白（SOX-9、ACAN和COLⅡ）表达最为明显。（4）裸鼠体内培养后发现水凝胶复合r BMSCs均成功再生软骨样组织,但联合应用组大体观相比于单独应用组和空白对照组表现出更白的软骨样质地;HE染色、Safranin-O染色和Ⅱ型胶原染色也表现出相同趋势,联合应用组具有更加典型的软骨陷窝结构并且更丰富的软骨特异性细胞外基质沉积;Western-blot结果表明,单独应用组与联合应用组均出现了软骨标志性COLⅡ蛋白,且SOX-9蛋白和ACAN蛋白表达较空白对照组更高。（5）负载r BMSCs的联合应用组水凝胶在裸鼠体内成功再生出管状气管样的软骨组织,组织学显示其具有典型的软骨陷窝结构和软骨特异性细胞外基质沉积。（6）兔气管软骨缺损造模并植入r BMSCs-水凝胶复合物后,12周取材大体观下,修复段气管组织与周围正常组织愈合良好,且能保持中通的管状形态;组织学结果显示修复段气管存在新生软骨组织形成并具有陷窝结构,其余部分被纤维组织填充。结论:（1）本研究通过修饰后的明胶和透明质酸成功制备了具有稳定结构,良好生物相容性,且易于塑形的新型水凝胶。（2）该水凝胶混合TGF-β1和KGN后具有软骨诱导功能,分别在体外和体内均能诱导出软骨样组织,并且可作为r BMSCs的载体,用于软骨缺损修复。（3）联合应用生长因子TGF-β1和小分子药物KGN可更好的促进BMSCs向软骨细胞分化,并再生出成熟的软骨陷窝结构。（4）联合应用生长因子TGF-β1和小分子药物KGN的水凝胶可用于兔气管缺损的修复。
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