论文部分内容阅读
雄蕊是植物体内重要的花器官,它的生长发育情况直接影响植株的繁育和农作物的产量。雄性不育是由于雄蕊发育异常而不能产生可育后代且普遍存在于植物界的一种现象,在农作物杂交育种研究中,雄性不育系对培育优质、高产的品种具有十分重要的作用。小麦(Triticum aestivum L.)是世界上三大粮食作物之一。因此,研究小麦雌雄蕊的发育对改良小麦品质和提高小麦产量都具有十分重要的意义。小麦雄蕊同源转化为雌蕊突变体(HTS-1)是彭正松教授在培育小麦三雌蕊(TP)近等基因系CSTP的过程中意外发现的一个新的突变体。HTS-1的小花中雄蕊全部或部分同源转化为雌蕊,故其雌蕊数目一般为4-6个。因此该突变体全部或部分不育,在自然状态下,平均结实率仅为15.3%。遗传分析发现,该突变体至少由2个隐性基因控制(Pis1和hts),与细胞质遗传无关。其中Pis1基因已被定于2D染色体上并且控制着三雌蕊小麦的三雌蕊性状。而hts基于已被定位在4A染色体上的一个7.2Mb的区间,结合前期的转录组分析,在该定位区间内找到了一个在雄蕊化雌蕊(PS)中表达量异常高的基因,即TaWin1基因。因此推测TaWin1基因的过表达会引起小麦雄蕊同源转化为雌蕊。为了进一步探究TaWin1的功能,本研究以三雌蕊近等基因系CSTP、CM28TP和小麦雄蕊同源转化为雌蕊突变体HTS-1为实验材料,采用基因克隆、外源乙烯利与1-甲基环丙烯处理、Real-time PCR检测及转基因拟南芥等方法分析了TaWin1基因的功能。主要结果如下:1、TaWin1基因在CM28TP和HTS-1中的序列相似性为99.77%,其唯一的区别为在HTS-1中TaWin1基因的ORF下游区段插入了两个胸腺嘧啶(T)。因此TaWin1基因在CM28TP和HTS-1中的片段大小为883bp和885bp,其开放阅读框(ORF)长度为408bp。在整个编码区中,TaWin1的氨基酸序列与节节麦A.tauschii Win1的相似度最高为96.38%,与花药野生稻O.brachyantha Win1和高粱S.bicolor Win1的相似性分别为64.23%和59.03%,与玉米Z.mays Win1相似性为58.82%,与拟南芥亚型A.lyrata subsp.Lyrata Win1相似性为38.57%,与水稻O.sativa Win1的相似性为62.77%。系统发育树分析表明,TaWin1蛋白与节节麦A.tauschii Win1、花药野生稻O.brachyantha Win1、水稻O.sativa Win1、高粱S.bicolor Win1及玉米Z.mays Win1同属一类。且TaWin1与节节麦A.tauschii Win1亲缘关系最近,因此进一步证实了TaWin1与Win1属于同一基因家族成员。Real-time PCR分析表明,与雌蕊(P)和雄蕊(S)相比,TaWin1基因在HTS-1的雌蕊化雄蕊(PS)中的表达量最高,约为正常雌蕊(P)的194倍,正常雄蕊(S)的86倍。2、利用乙烯利和1-甲基环丙烯(1-MCP)分别处理CSTP和HTS-1,其雌雄蕊性状发生明显变化,未经任何处理的HTS-1雌蕊化率为59.61%,CSTP为0.30%,经1-MCP处理的HTS-1雌蕊化率为35.27%,经乙烯利处理的CSTP雌蕊化率为40.53%。经过1-MCP处理的HTS-1较未经任何处理的HTS-1的雌蕊化现象降低了24.34%,经乙烯利处理的CSTP较未经任何处理的CSTP的雌蕊化率升高40.23%。利用Real-time PCR分析了乙烯通路中关键基因的表达情况。结果表明ACO2、CTR1及EIN2在HTS-1的幼穗中的表达量较CSTP高,HTS-1经过1-MCP处理后其表达量下降,CSTP经过乙烯利处理后其表达量其表达量上升。ETR1和SAM基因在HTS-1的幼穗中表达量明显高于CSTP,HTS-1经1-MCP处理后表达量下降。ETR和SAM基因在经乙烯利处理的CSTP和未处理的CSTP幼穗中表达量均较低,且差异不明显。ACS的在HTS-1中的表达量高于CSTP(约6倍),经过1-MCP处理后HTS-1的表达量显著升高。经乙烯利处理的CSTP幼穗中ACS的表达量较未处理的CSTP升高。在所测定的6个基因中,EIN2基因的表达差异最为明显,EIN2基因在1-MCP处理的HTS-1中其表达量较未处理的HTS-1下调了约15倍,在乙烯处理的CSTP中其表达量较未处理的CSTP上调了约16倍。TaWin1基因在HTS-1的幼穗中表达量高于CSTP。HTS-1经1-MCP处理后其幼穗中TaWin1基因的表达量上调约9.5倍。而CSTP经乙烯利处理后幼穗中的TaWin1基因的表达无明显变化。3、利用转基因拟南芥技术进一步分析TaWin1基因的功能,结果发现在拟南芥中TaWin1基因的过量表达导致拟南芥出现了一系列表型上的变化,如花丝和花梗长度明显缩短、花丝退化、花丝降解等。利用Real-time PCR分析了拟南芥中乙烯合成的三个关键酶基因AtACO2、At ACS和AtSAM在转基因拟南芥和野生型拟南芥中的表达情况,结果表明除At ACO2基因外,其它2个关键酶基因AtACS和At SAM在转基因拟南芥中均上调表达。这说明TaWin1在一定程度上促进了拟南芥中乙烯的合成。