在人类与艾滋病30多年抗争的历程中,抗HIV-1药物的研发和应用是取得的最大成就之一。1996年首次将不同种类的药物联合应用,建立了高效抗逆转录病毒疗法(HAART),能够把HIV-1复制抑制到现有方法检测不到的水平,大幅度降低了病死率,提高了生存质量。基于抗病毒治疗以及减少HIV-1传播的巨大成功,近几年国际上把扩大治疗和预防性治疗作为艾滋病预防控制的新型策略,提倡早治疗和对处于感染危险之下的人暴露前/后预防用药。截至2015年6月,全世界已有约1600万人接受过艾滋病抗病毒治疗。因此,与20年前不同的是,目前HIV-1是在普遍存在的药物压力下传播和进化的。HIV-1具有高度的变异性和极快的复制速率,易在药物选择压力下快速产生耐药性。目前对所有种类的抗HIV-1药物均已报道了耐药毒株,这将导致药物失效和治疗失败。因此,研发对耐药病毒株有效的新型抗HIV-1药物仍然是艾滋病预防控制的迫切需要。临床前药效学研究是抗HIV-1新药研发的基础,对耐药HIV-1毒株抑制活性的评价是新药临床前药效学研究的重要内容。美国FDA抗HIV-1药物药效学研究指南建议,将耐药性研究作为抗病毒药物药效学研究的重点。相对于野生型毒株抑制活性的评价,对耐药毒株的药效学研究面临许多特殊问题:(1)我国既往对HIV-1耐药的研究主要是基因型检测和分析,尚不具备标准化的表型耐药检测方法以及不了解流行毒株的表型耐药特征。(2)由于已经在临床上使用的抗HIV-1药物种类较多,病人往往携带多种多个耐药突变,不同突变对药效的影响不同并难以评估。(3)常规使用的评估指标(IC50及其与野生毒株相比提高的倍数)难以准确评估蛋白酶抑制剂(PIs)和多数非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)耐药毒株的药效改变。针对这些问题,本研究首先建立了基于重组病毒的HIV-1表型耐药检测方法,了解我国主要流行毒株对常用药物的表型耐药情况。然后借此方法评估了常用抗病毒药物对携带多种耐药突变和突变型的HIV-1毒株的抑制活性,提出了一个新的评价参数。根据对HIV-1复制和抗HIV-1药物抑制活性的了解,采用所建立的表型耐药检测方法及其他研究方法,利用所建立的评价参数,对设计的两个新型抗HIV-1候选药物(新型蛋白酶抑制剂和针对Vpu-tetherin相互作用的多肽)进行了临床前抗病毒活性研究,尤其是临床前耐药性相关研究,并初步探讨了可能的作用机制。第一章基于重组病毒的HIV-1表型耐药检测方法的建立及我国流行毒株表型耐药特征的研究目前常用的HIV-1耐药检测方法有基因型和表型两种。基因型耐药检测方法由于快速且价格低廉,被广泛开展。表型耐药检测方法由于对实验室和技术要求较高开展较少,但是该方法在耐药位点鉴定以及新型抗HIV-1药物的活性研究等方面是必须的。我国HIV-1毒株流行呈现复杂的多样性,目前对HIV-1毒株基因型耐药的研究较多,但缺乏标准化的表型耐药检测方法,对流行毒株的表型耐药特征亦不了解。本章的目的是建立一种基于重组病毒的HIV-1表型耐药检测方法,并借此了解我国主要流行毒株对常用抗HIV-1药物的表型耐药性,从而对以基因型为基础的耐药毒株监测结果提供补充,为制定药物使用策略以及临床合理用药提供依据。方法与结果:(1)采集全国10个省市的28例艾滋病患者的血浆标本,收集临床和流行病学信息。提取纯化病毒RNA,巢式RT-PCR扩增获得gag-pol目的片段,包含编码蛋白酶的全部密码子(1-99个)以及逆转录酶的前312个密码子。目的片段测序后编辑整理,提交至美国斯坦福大学HIV耐药数据库,得到基因型耐药检测结果,系统进化分析得到病毒的基因亚型。病毒的基因型包含B、CRF01_AE和CRF07_BC,仅2例存在耐药突变,其余无任何耐药相关突变。(2)以野生型p NL4.3质粒为骨架,将来自病人的gag-pol目的片段克隆至p NL4.3-Δ(Sph I-Age I)上,构建重组感染性克隆,转染293T细胞,获得19株具有稳定复制能力的重组病毒。利用MT2/TZM-bl细胞的荧光素酶报告系统,在生物安全三级实验室检测重组病毒对6种目前常用一线抗HIV-1药物(AZT/3TC/d4T/dd I/NVP/EFV)的表型耐药性,重复3次,获得114组表型耐药检测数据。(3)将基因型和表型耐药检测结果进行比较分析。基因型与表型耐药检测结果的一致率为96.5%。1例接受过治疗的河南患者(HN2009001)携带M41LL210WT215YK103NK238T耐药突变,对6种药物均表现为耐药,IC50提高3.92-126.75倍,说明检测结果准确。14例未检出任何耐药基因突变的患者对6种药物均敏感,另有4例未检出任何耐药基因突变的病人,对NVP或EFV的IC50提高3.41-7.84倍。小结:建立了一种基于重组病毒的HIV-1表型耐药检测和研究方法,多数表型与基因型耐药检测结果一致,可以对HIV-1的表型耐药水平进行准确定量评估,为研究HIV-1的耐药性以及新型抗HIV-1药物的临床前药效学奠定了方法基础。发现了基因型无耐药突变但表型显示中低度耐药的病例,提示存在其他导致耐药的因素,值得深入研究。第二章主要HIV-1耐药突变及突变型对药效的影响及新型评价参数的建立评估药物对HIV-1耐药毒株的抑制活性,目前使用的指标是药物对病毒50%抑制活性(IC50)及其相对于野生毒株提高的倍数。制定这个指标的前提是假设耐药突变仅导致剂量反应曲线向右平移,对曲线的形状没有影响。而实际上耐药突变对药效可产生全面的影响,不仅IC50提高,剂量反应曲线的斜率也会发生变化,甚至只有斜率的下降。而目前携带各类耐药突变或突变型的病毒对各类抗HIV-1药物药效的影响还不清楚,使用的指标也难以准确评估对各类药物的表型耐药性。本章的目的是借助第一章所建立的HIV-1表型耐药检测方法,阐明主要耐药突变或突变型对各类抗HIV-1药物的药效影响,提出新的考虑了IC50和斜率的评价参数。方法与结果:(1)以野生型p NL4.3质粒为骨架,定点突变构建重组感染性克隆质粒,转染获得8株能稳定复制的携带不同耐药突变的重组病毒。(2)在生物安全三级实验室测定已上市的10种抗HIV-1药物对重组病毒的抑制活性,绘制剂量反应曲线,重复3次。结合实验室之前已有的数据,共获得22个耐药毒株对10种抗HIV-1药物的药效学数据。(3)概括每种突变毒株对各种抗HIV-1药物的药效学特征。发现各类耐药突变对不同药物的药效学参数影响不同,有三种情况:(1)仅影响IC50,对斜率无任何影响。多数核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)耐药突变属于这种情况;(2)对IC50和斜率均产生影响。例如携带K103NH221YY181CT215Y突变的重组病毒使得EFV的IC50增加13.36倍,同时斜率下降为原来的一半;(3)仅改变剂量反应曲线的斜率而对IC50无影响。在非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)和蛋白酶抑制剂(PIs)耐药毒株中这种情况较为多见。例如,携带G48VI54V突变的重组病毒不影响RTV的IC50但降低斜率,携带V82A突变的重组病毒株使SQV的斜率降为野生毒株的0.41,但IC50无变化。(4)综合考虑IC50和斜率,并纳入临床前研究可获得的最大无毒浓度等数据,首次提出新的药效学评价参数IIP atoxic,所有药物的IIP atoxic均与文献报道的纳入临床最大血药浓度的参数IIP max具有良好的相关性(r>0.95,P<0.001)。小结:阐明了常见和主要的HIV-1耐药突变和突变型对10种抗HIV-1药物的药效学特征,发现不同类型的耐药突变或突变型对IC50和/或斜率有不同的影响,PIs和NNRTIs耐药突变对剂量反应曲线的斜率影响最为明显。首次提出了新的综合考虑IC50和斜率的可用于临床前药效学研究的评价参数IIP atoxic,可在没有药代学数据时评估对耐药毒株的抑制活性,为针对耐药毒株的临床前药效学研究提供了全面准确的评价参数。第三章新型蛋白酶抑制剂DG35的抗HIV-1活性研究我国目前还没有一种在临床应用的具有自主知识产权的抗HIV-1药物。DG35是我国自主研发的以HIV-1蛋白酶为靶标的小分子化合物,对其抗HIV-1活性还不清楚。本章旨在评估DG35的临床前抗HIV-1活性,为该药的后续研发提供临床前药效学数据。方法与结果:按照FDA推荐的抗HIV-1药物临床前药效学研究内容,采用之前建立的HIV-1表型耐药研究方法及构建的病毒株,利用所建立的评价参数,采用高通量筛选和评价方法,分别从细胞毒性、对不同基因背景的病毒株的抑制活性、药物联合配伍效果以及加压诱导耐药毒株等几个方面,对DG35进行全面的临床前活性研究,尤其是临床前耐药性研究。研究发现:(1)DG35在本实验条件下具有肯定的抗HIV-1的活性,且对野生型参考病毒株(HIV-1NL4.3)的IC50(3.58±0.10n M)低于已在临床应用的IDV(7.19±1.01n M),斜率(3.42±0.58)高于IDV(2.49±0.23)。(2)DG35对携带M46I、I54V、V82A、M46IN88S和M46IV82TI84V耐药突变病毒株的抑制活性与野生型参考病毒株的抑制活性相当(1.02-12.46n M)。与HIV-1NL4.3相比,携带蛋白酶抑制剂耐药突变(G48VI54V)的毒株对DG35不仅IC50提高了65.57倍,且剂量反应曲线的斜率也发生变化,其IIP atoxic值亦下降。而DG35对3株NNRTIs耐药毒株具有良好的抑制活性。(3)DG35与AZT(NRTI)、EFV(NNRTI)和RTV(PI)均有高度的协同抗HIV-1作用,协同指数分别为592.28n M2%、661.33n M2%和528.72n M2%。(4)体外药物加压诱导培养,连续传6代,未诱导出DG35的耐药毒株。小结:DG35对实验室传代毒株具有较强的抑制活性,对于常见的PIs耐药毒株也有一定的抑制活性,但对携带G48VI54V和G48VI54VV82A突变的蛋白酶抑制剂耐药毒株的活性有所下降,与NNRTIs无交叉耐药性。与目前临床使用的三种抗HIV-1药物具有高度协同作用,同时具有较高的耐药基因屏障。这些结果为该药的后续研发奠定了基础。第四章以Vpu-tetherin相互作用为靶标的抗HIV-1多肽的设计和活性研究HIV-1几乎对于目前已上市的所有药物均出现了耐药性,需要研究针对新靶点的药物。Tetherin(THN)是宿主细胞表面的蛋白,可以将HIV-1粘附到细胞表面阻断其出芽复制,是人体细胞天然的抗病毒机制。HIV-1在进化过程中获得了Vpu,利用细胞内蛋白降解途径介导tetherin降解,从而对抗细胞的天然抗病毒功能。阻断Vpu对tetherin的降解作用是有前景的抗HIV-1新靶标,然而到目前为止,还没有报道任何一种小分子或者多肽可以阻断Vpu与tetherin的相互作用。本章的目的是设计针对Vpu-tetherin相互作用的抗HIV-1多肽,进行活性验证,探讨可能的作用机制,为新靶点药物研发提供新的思路。方法与结果:(1)检索野生型参考病毒株HIV-1NL4.3Vpu的氨基酸序列,以10个氨基酸为一个跨度,设计、合成了7条可能竞争性阻断Vpu与tetherin结合的Vpu多肽类似物。同时从Vpu多肽中随机选择20个氨基酸合成2条随机多肽,作为对照。(2)利用前期建立的药效学研究方法进行抑制活性的确证。获得了3条具有一定抑制活性的多肽,分别命名为CJ128、CJ130和CJ131,IC50分别为4.29±0.05μM、3.75±0.13μM和3.50±0.21μM,而两条随机多肽对于HIV-1NL4.3未表现出任何抑制活性。(3)Vpu和tetherin在细胞内共表达,Western blot实验表明CJ128和CJ130可以恢复tetherin的表达水平,多肽可能通过阻断Vpu介导的tetherin的降解以抑制HIV-1的复制。(4)激光扫描共聚焦显微成像发现所有活性多肽确实结合于细胞表面,从而可能与存在于细胞表面的tetherin结合而发挥抑制作用,而对照多肽则无此现象。小结:设计合成了3条具有潜在抗HIV-1活性的多肽,可抑制Vpu依赖的病毒颗粒的释放,证实其定位于细胞表面,可能与Vpu竞争性地结合存在于细胞表面的tetherin,对Vpu介导的tetherin的降解产生一定的阻断作用,以抑制HIV-1的复制。我们的研究首次证实竞争性阻断Vpu与tetherin的结合是抑制HIV-1复制的有效方式,这为进一步基于这个靶点的药物研发提供了基础,具有良好的研究和应用前景。