叶片衰老是受遗传程序严格控制的发育过程,由特殊发育信号通过一定的信号传导路径来启动和控制。分离、鉴定参与启动和调控叶片衰老过程的关键基因,并对其功能进行深入的分子生物学分析,是揭示植物叶片衰老分子机制的重要课题。在叶片衰老过程中,营养物质从衰老叶片向新生的组织器官发生转移。细胞自噬作为叶片衰老过程中的重要事件,参与到叶片衰老过程中氮(N)素等营养物质的再动员,对自噬的研究也有助于理解叶片衰老过程中营养物质的转运过程。本文的研究内容分为两部分。第一部分主要是对AtSARK与SSPP互作调控叶片衰老分子机制的研究。我们实验室的前期工作发现,大豆LRR型类受体蛋白激酶基因GmSARK以及它在拟南芥中的同功能基因：另一个LRR型类受体蛋白激酶基因AtSARK,具有正向调控叶片衰老的功能,它们通过生长素和乙烯的协同作用参与植物叶片衰老的正调控过程,并且GmSARK和AtSARK都是丝／苏氨酸和酪氨酸双底物特异性蛋白激酶。此外,实验室前期还分离鉴定了一个参与叶片衰老负调控过程的蛋白磷酸酶编码基因,SSPP。SSPP的转录水平受到自然衰老和SARK诱导的衰老的抑制,并且过表达SSPP转基因拟南芥具有衰老延缓的表型。在此基础上,我们对SSPP的生化特点的研究发现,SSPP编码一个依赖于镁离子的PP2C型蛋白磷酸酶。我们发现在拟南芥中过表达SSPP不仅能延缓拟南芥的自然衰老,还能延缓黑暗诱导的叶片衰老表型,并且发现SSPP过表达能引起黄化苗乙烯释放量的减少以及对ACC处理敏感性的下降。我们将SSPP在GVG:AtSARK的背景下过表达,发现AtSARK诱导的早衰现象消失,并且AtSARK诱导的衰老相关标志基因的转录水平上调现象在GVG:AtSARK/35S:SSPP双转基因材料中也被抑制,说明SSPP能抑制AtSARK在叶片衰老中的功能。进一步的体外磷酸化实验发现SSPP能以AtSARK-CD为底物,对发生了自磷酸化的AtSARK-CD进行脱磷酸化作用,而AtSARK-CD则不能以SSPP为底物。Pull-down实验发现SSPP能与AtSARK-CD发生直接的相互作用,并且通过双分子荧光互补实验(BiFC)证明,SSPP与AtSARK能在植物细胞的质膜上发生互作。这些结果暗示SSPP可能通过对AtSARK磷酸化状态的控制发挥其对叶片衰老负调控的功能。此外,本研究发现SSPP还能与大豆GmSARK的激酶域(GmSARK-KD)发生互作,暗示着PP2C型蛋白磷酸酶SSPP与LRR型类受体蛋白激酶SA RKs的这种调控关系在高等植物中是一种普遍机制。我们的这些结果表明SSPP通过与AtSARK发生互作,负向调控叶片衰老的起始和进程。在此基础上,为了深入研究AtSARK与SSPP互作调控叶片衰老的具体机制,发掘AtSARK上被SSPP攻击的磷酸化位点,我们首先对AtSARK关键的自磷酸化位点进行了分析鉴定。质谱分析发现,AtSARK胞内域(AtS ARK-CD)在自磷酸化发生后,有27个氨基酸残基发生了磷酸化,其中有2个位于近膜域,15个位于激酶域,还有10个位于CT域。对所有27个位点进行定点突变,用丙氨酸(A)或苯丙氨酸(F)模拟该位点的非磷酸化状态,用天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)模拟突变位点的磷酸化状态,并对影响AtSARK-CD自磷酸化的关键位点进行了鉴定,发现了影响AtSARK自磷酸化的关键位点。基于对AtSARK-CD磷酸化位点的分析,我们对SSPP与AtSARK互作的具体机制进行了初步的探索。用pull-down的方法对一些自磷酸化位点的点突变对AtSARK-CD与SSPP的互作影响进行了分析。发现两个位点的点突变具有影响互作的功能：AtSARK-CDT189D所模拟的组成型的磷酸化状态影响了SSPP与AtSARK的相互作用,这个结果暗示了在叶片衰老过程中,可能存在某种通过对SARK结构或者磷酸化状态的改变来解除SSPP对SARK抑制作用的分子机制；AtSARK-CDS369A影响互作而AtSARK-CDS369D不影响互作的结果暗示S369是重要的AtSARK上与SSPP发生互作的位点,发生在CT域上S369的磷酸化能为SSPP提供锚定位点。在此基础上,我们对T189位点的生物学功能进行了分析,发现影响与SSPP互作的点突变则会保持AtSARK的功能,说明AtSARK的功能与SSPP的互作有关。最后,为了进一步研究AtSARK和SSPP调控叶片衰老的分子机制,我们分别对AtSARK和SSPP的其他互作组分进行了筛选。首次用酵母双杂交的方法筛选了AtSARK-CD在拟南芥cDNA文库中的互作组分,获得83个候选组分,它们大部分为参与各种代谢过程的酶,参与基因表达调控相关的蛋白以及参与信号传导的蛋白。我们对其中的一个表达受到衰老抑制的、推测为醛缩酶的候选组分FBAL与AtSARK-CD的互作进行了验证。另一方面,我们以SSPP为诱饵蛋白通过酵母双杂交的方法筛选了SSPP的互作组分,获得19个候选组分,其中大部分属于生长素响应蛋白家族成员。令人感兴趣的是,我们筛选到了一个推测为Ring型的E3连接酶组分同时出现在AtSARK和SSPP的候选互作组分中,命名为KPIL (Kinase and Phosphatase co-Interacted E3Ligase),我们通过BiFC实验证明KPIL能分别与AtSARK和SSPP在植物细胞内发生互作。本文的第二部分对大豆自噬基因GmATG8c的生化功能和生物学功能进行了研究。细胞自噬是一种进化上保守的多功能真核生物细胞器降解机制,能被多种生理胁迫状态所诱导,通过对细胞组分的降解,实现营养物质的回收利用。前期研究发现影响植物自噬的突变体表现为种子产量下降而促进自噬的过表达材料表现出明显的生长促进。由于酵母ATG8具有介导自噬体形成的功能,是处于自噬进程中心位置的重要蛋白,我们推测作物中ScATG8的同源基因可能具有NUE潜力。通过序列分析,我们发现大豆基因组中有11个编码ATG8的同源基因。基于实验室前期对大豆ATG8s在缺氮条件下的转录分析结果,我们选择GmATG8c进行功能验证分析。用免疫印迹分析的方法对APE1的装配进行了检测,发现在回补菌株中,在正常和氮饥饿条件下的APE1装配都得到了部分的恢复,表明GmATG8c具有酵母ScATG8的功能；此外,在正常和缺氮条件下,GmATG8c的过表达拟南芥中的MDC染色小体(推测为自噬小体)数量都显著增加,暗示过表达GmATG8c增强植物的自噬。并且过表达GmATG8c的转基因大豆愈伤组织表现出促进愈伤组织生长,增强愈伤组织低氮胁迫耐受性的表型。综上所述,本课题首次研究了拟南芥叶片衰老相关的蛋白磷酸酶SSPP调控叶片衰老的分子机制,发现在叶片衰老调控过程中,SSPP通过与AtSARK的互作,参与叶片衰老的负调控；进一步,我们分析鉴定了影响AtSA RK自磷酸化状态以及与SSPP互作的关键位点,并分别筛选了AtSARK和SSPP的其他互作组分；这些为我们进一步了解植物叶片衰老调控的分子机制奠定了基础。此外,我们证明了GmATG8c是酵母ATG8的同源基因,具有提高植物低氮耐受性的潜力,为大豆高产高效新品种的培育提供了重要基因资源。