2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid,2KGA）是抗氧化剂D-异抗坏血酸及其钠盐合成的前体物质,被广泛应用于食品、药品、化工等领域。膜结合葡萄糖酸脱氢酶（gluconate dehydrogenase,GADH）是2KGA生物合成过程中一种重要的氧化还原酶,为提高2KGA的生产效率,有必要对其进行深入研究。本论文以2KGA生产菌株粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）JUIM03为研究材料,利用Triton X-114两相分离技术和层析技术从该菌株中分离纯化膜结合GADH,随后采用SDS-PAGE、可见光吸收光谱和MALDI-TOF-MS技术对纯化的蛋白进行分析,同时利用高效液相色谱和红外光谱技术对其催化氧化葡萄糖酸的产物进行鉴定,并系统研究膜结合GADH的酶学特性。在此基础上,采用LA-PCR（long and accurate polymerase chain reaction）技术克隆膜结合GADH的基因,并利用生物信息学在线分析工具和相关软件明确膜结合GADH蛋白的生物学信息。主要研究结果如下:（1）通过超声破碎细胞、Triton X-114两相分离、盐析、DEAE-sepharose阴离子交换层析和羟基磷灰石吸附层析等步骤,从粘质沙雷氏菌JUIM03中获得比活为91.43 U/mg、纯化倍数为160倍及回收率为3.8%的膜结合GADH。SDSPAGE分析结果表明,纯化获得的膜结合GADH由三个亚基组成,其中大亚基为含有FAD的分子质量约为65.0 k Da的黄素蛋白,中亚基和小亚基的分子质量分别约为45.0 k Da和23.0 k Da。可见光吸收光谱和MALDI-TOF-MS分析结果进一步表明,从粘质沙雷氏菌JUIM03中纯化的GADH确实为FAD依赖性的膜结合GADH。高效液相色谱和红外光谱分析结果表明,粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化氧化葡萄糖酸的产物为2KGA。（2）酶学性质研究结果表明,粘质沙雷氏菌JUIM03膜结合GADH的最适反应温度为40°C,最适反应p H值为5.0,且在30⁴0°C和p H 5.0⁷.0之间具有较好的稳定性;Na+对膜结合GADH活性没有影响,Mg2+对该酶具有促进作用,而Mn2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等金属离子对该酶均有不同程度的抑制作用;变性剂巯基乙醇和SDS对膜结合GADH均有不同程度的抑制作用;EDTA对膜结合GADH的催化活性基本没有影响;有机酸如乙醇酸、乙醛酸和2KGA对膜结合GADH的催化活性基本没有影响,而草酸和草氨酸对该酶具有强烈的抑制作用;甲醇、丙酮、异丙醇和乙醇等有机溶剂对膜结合GADH活性均有不同程度的抑制作用;来源于粘质沙雷氏菌JUIM03膜结合GADH具有严格的底物特异性,即只有在D-葡萄糖酸作为底物时才具有催化活性,其Km值为1.33mmol/L。（3）采用LA-PCR技术从粘质沙雷氏菌JUIM03中克隆了葡萄糖酸脱氢酶操纵子（gad操纵子）的全长序列。生物信息学分析结果表明,gad操纵子具有三个结构基因,依次为gnd S、gnd L和gnd C,相对应的核苷酸序列长度分别为729bp、1782 bp和1338 bp。gnd S基因与S.marcescens SGAir0764葡萄糖酸脱氢酶小亚基基因序列的一致性为98%,其编码的蛋白属于gluconate₂-dh3 superfamily,为跨膜蛋白;基因gnd L与S.marcescens UMH8葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因序列的一致性为99%,其编码的蛋白属于GMC_oxred_C superfamily,为跨膜蛋白;基因gnd C与S.marcescens UMH8葡萄糖酸脱氢酶中亚基基因序列的一致性为99%,其编码的蛋白属于cytochrom?C superfamily,无跨膜结构域。