猪的体细胞克隆在农业和医学领域都有着巨大的应用潜力。尽管体细胞克隆猪在多个国家已取得成功，但总的克隆效率还很低。普遍认为，体细胞克隆的低成功率与供体细胞核的不完全表观重编程有关，对核重编程机制的进一步理解，将有利于体细胞核移植效率的提高。本研究的试验方法和结果简述如下：　　 1.体细胞核移植胚胎中的DNA甲基化重编程是不完全的，而异常的DNA甲基化模式是导致体细胞克隆效率低的主要原因。为了促进核的重编程，在进行核移植之前对广西巴马小型猪供体细胞分别用曲古菌素A，5-氮-2-脱氧胞苷或者二者联合处理。结果表明：不同处理对供体细胞的细胞周期状态无显著影响；通过检测供体细胞中DNMT1，DNMT3a，HDAC1和IGF2的转录水平发现联合处理组HDAC1的表达水平显著下降，而IGF2的表达水平显著上升(P<0.05)；并且，曲古菌素A和5-氮-2-脱氧胞苷联合处理供体细胞，不仅提高了核移植胚胎的囊胚发育率(16.0% vs25.6%，P<0.05)，同时还提高了供体细胞和核移植囊胚的DNA甲基化水平(P<0.05)，而用曲古菌素A或5-氮-2-脱氧胞苷单独处理供体细胞，对核移植早期胚胎的发育能力和甲基化水平都无显著影响(P>0.05)。本研究结果表明，与曲古菌素A联合作用，低浓度的5-氮-2-脱氧胞苷也可发挥其去甲基化活性，从而有效提高了巴马小型猪核移植胚胎的囊胚发育率。　　 2.克隆了广西巴马小型猪Oct4基因，构建真核表达载体，并使其在成纤维细胞中表达。首先从巴马小型猪睾丸组织中扩增Oct4基因编码全序列。然后将该基因重组于含有绿色荧光报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中，构建pEGFP-Oct4重组质粒，通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明重组质粒构建成功。在脂质体2000介导下转染猪睾丸成纤维细胞，经400μg/mL的G418筛选，获得稳定转染的阳性细胞株。稳定转染的细胞分别经RT-PCR和Western blotting检测表明，细胞中表达Oct4 mRNA和pEGFP-Oct4融合蛋白，说明巴马小型猪的Oct4基因在猪睾丸成纤维细胞中成功表达。　　 3.对稳定表达pEGFP-Oct4细胞的多能性进行检测，并以转基因细胞为供体构建核移植胚胎。RT-PCR检测和免疫荧光染色的结果都表明，在稳定转染Oct4的成纤维细胞中，不仅有Oct4的表达，还表达另外两个转录因子Sox2和Nanog。而且，转染Oct4的成纤维细胞经悬浮培养，可形成类胚体，经RT-PCR检测，类胚体表达内胚层和外胚层的分化标志基因。对转染Oct4的细胞进行核型分析，核型正常。随后的核移植实验表明，以稳定表达pEGFP-Oct4/pEGFP-N1的细胞或未转染的成纤维细胞为供体构建的核移植胚胎，其囊胚发育率无显著差异(27.3%，19.3% vs.21.2%，P>0.05)。这些结果表明，Oct4可使分化的体细胞具有一定的多能性，转染pEGFP-Oct4到供体细胞对猪克隆胚胎的早期发育能力无显著影响。　　 4.探讨了TSA，5-aza-dC，和TSA+5-aza-dC对猪植入前克隆胚DNA甲基化和胚胎发育能力的影响。结果显示，用5-aza-dC或者TSA+5-aza-dC处理转基因体细胞，可显著降低其DNA甲基化水平(P<0.05)。分别以TSA，5-aza-dC和TSA+5-aza-dC处理过的稳定转染pEGFP-Oct4的成纤维细胞为供体构建核移植胚胎，实验组和对照组之间胚胎分裂率和囊胚率无显著差异。这些结果表明，TSA和5-aza-dC联合处理转染pEGFP-Oct4的成纤维细胞显著降低了细胞和核移植囊胚的DNA甲基化水平，但以DNA甲基化降低的细胞为供体，并没有促进核移植胚胎的发育。TSA和5-aza-dC联合作用对核移植胚胎体外发育的影响可能与核供体细胞类型有关。