【摘 要】
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目的:探讨纤维连接蛋白（fibronectin,FN）在移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）中的作用,并研究外源性FN多肽在慢性GVHD（chronic graft-versus-host disease,cGVHD）中的治疗作用及作用机制,为cGVHD治疗提供新思路及理论依据。方法:通过提取小鼠DNA,经PCR后凝胶电泳,通过DNA条带大小筛选FN基因敲
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目的:探讨纤维连接蛋白（fibronectin,FN）在移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）中的作用,并研究外源性FN多肽在慢性GVHD（chronic graft-versus-host disease,cGVHD）中的治疗作用及作用机制,为cGVHD治疗提供新思路及理论依据。方法:通过提取小鼠DNA,经PCR后凝胶电泳,通过DNA条带大小筛选FN基因敲除（knockout,KO）小鼠,并通过ELISA法测定血浆FN水平,以验证他莫昔芬诱导下的FN KO小鼠KO效率,构建FN KO小鼠模型。受者小鼠接受全身照射预处理后,回输一定剂量的全不相合或半相合供者小鼠来源的骨髓细胞与脾细胞,建立急性GVHD（acute graft-versus-host disease,aGVHD）与cGVHD小鼠模型,包括BALB/c到C57BL/6和DBA/2到BALB/c的cGVHD小鼠模型。对GVHD进行临床表现观察、评分,利用病理HE染色和masson’s trichrome染色对GVHD进行评分,比较FN KO小鼠与FN lox P+/+,Cre-小鼠的GVHD程度,以研究下调FN水平对急慢性GVHD的影响。在不同的移植模型,包括BALB/c到C57BL/6和DBA/2到BALB/c的小鼠GVHD模型,通过尾静脉注射及腹腔注射外源性FN多肽上调小鼠体内FN水平,比较接受FN多肽组与接受PBS的对照组的GVHD程度,以研究上调FN对急慢性GVHD的影响,以及FN多肽在GVHD中的治疗作用。利用流式细胞术分析脾脏和骨髓中B细胞和F4/80+巨噬细胞的比例,利用流式细胞术CBA法检测IL-6,IL-10,MCP-1,TNF,IFN等细胞因子水平,利用免疫荧光染色技术分析受者靶组织皮肤、肝脏、肺脏、肾脏的F4/80+CD206+M2型巨噬细胞浸润情况,以及抗体沉积情况,以研究FN多肽调节cGVHD的作用机制。结果:在BALB/c到C57BL/6小鼠中,C57BL/6受者小鼠接受总剂量为11Gy的TBI后,每只受者小鼠接受来自于BALB/c供者小鼠的5*10^6个骨髓细胞与3*10^6个脾细胞可诱导aGVHD,3*10^6个骨髓细胞与（0.1-1.5）*10^6个脾细胞可诱导cGVHD。BALB/c小鼠为受者的模型中,BALB/c受者小鼠接受单次总剂量为8Gy的TBI后,接受DBA/2供者来源的1*10^6个骨髓细胞与（10-15）*10^6个脾细胞后,可诱导cGVHD。cGVHD小鼠可表现出体重下降、脱毛、姿势异常、活动度下降、倦怠以及纤维化特征的皮肤硬皮病等临床表现。小鼠cGVHD模型上病理上常可见靶组织炎症浸润、组织损伤及纤维化病变。与对照组相比,利用FN KO小鼠下调FN水平对aGVHD的生存曲线无明显影响,但是在cGVHD模型中,FN KO小鼠临床及病理表现均较重。通过外源性FN多肽上调FN水平对aGVHD的生存曲线无明显影响,但是在BALB/c到C57BL/6小鼠cGVHD模型。尾静脉注射FN多肽组小鼠生存期较长,腹腔注射FN多肽组小鼠cGVHD较轻;在DBA/2到BALB/c小鼠cGVHD模型中,腹腔注射外源性FN多肽组小鼠较对照组小鼠cGVHD较轻。外源性FN多肽组小鼠体内MCP-1水平减低,M2型巨噬细胞在肝脏、肺脏靶组织浸润明显减少,抗体在肾脏沉积明显减少。结论:FN KO对aGVHD无明显影响,外源性FN多肽在aGVHD中无明显作用。但是FN在cGVHD中有保护性作用,FN KO将加重cGVHD,予外源性FN多肽上调FN水平可减弱cGVHD,且FN多肽对cGVHD的治疗作用呈非模型依赖性。FN多肽可能是通过减低MCP-1抑制M2型巨噬细胞迁移并浸润靶组织。靶组织中M2型巨噬细胞减少将减少TGF-β产生,且抗体沉积减少,减弱了cGVHD。
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