研究背景原发性肺癌是当今世界上严重危害人类健康和生命的常见恶性肿瘤之一。根据肿瘤组织形态学的不同,肺癌主要分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC,包括腺癌、鳞癌和大细胞癌),SCLC发病率约占原发性肺癌的15%,分化程度低,易较早发生血行转移,预后极差。虽然SCLC对初始化疗比较敏感,但极易发生多药耐药(multi-drug resistance, MDR)现象,从而导致化疗失败。因此,SCLC的多药耐药性是目前SCLC基础应用研究和临床治疗亟待解决的问题之一。同源异型盒(homeobox)基因是细胞分化、增殖和凋亡等生物学过程的关键调节基因,参与胚胎发育和个体生长的调节。哺乳动物的同源异型盒基因分为两类,其中有一类成簇排列在染色体上并按前后轴(A-P)的方式表达,称Ⅰ类同源异型盒基因(A-P型),又称HOX基因；另一类散布在不同染色体上,称为非Ⅰ类同源异型盒基因(非A-P型,non-HOX, para HOX),又称非丛集基因、分散(歧义)的同源异型盒基因。人类HOX基因至少有39个,分为A、B、C、D四簇,分别位于不同的染色体7p15、17p21、12q13和2q3l上。每簇包含有9-11个基因沿DNA序列3’-5’依次同源排列。若同源异型盒基因表达出现异常,不仅会导致个体发育和组织器官形成过程中出现异常形态结构,还可导致前列腺癌、宫颈癌、口腔癌等恶性肿瘤的形成。也有研究表明同源异形盒基因可以调节肿瘤的凋亡或耐药性。Zhang等发现,人乳腺癌细胞自分泌人生长激素后可增加HOXA1的表达和转录活性,HOXA1可以通过对BCL-2表达的上调而增加细胞的存活,还可以使乳腺癌细胞逃避阿霉素诱导的凋亡。E-cadherin通过Racl增加乳腺癌细胞中HOXA1的表达,进而促进细胞增殖及减少细胞凋亡。然而,HOX基因是否参与小细胞肺癌细胞的凋亡和耐药性的产生,目前尚无相关报道。MicroRNAs (miRNAs)是近年来在真核生物中发现的一类由19-25个核苷酸组成的非编码RNA,广泛存在于线虫、果蝇、小鼠和人等物种,通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或抑制其翻译,从而对靶基因进行转录后的表达调控,在多种生物学活动包括细胞分化、增殖、凋亡和细胞周期改变等过程中发挥重要的调控作用。已有研究发现miRNAs可通过调节靶基因的表达参与调节肿瘤细胞的耐药性,这些靶基因包括药物转运、细胞凋亡、增殖、周期变化等相关基因,HOX基因就是其中之一。已有研究表明HOX基因表达与miRNAs密切相关,某些miRNAs与HOX基因的染色体所在位点具有密切联系。miR-10a和miR-196-1位于染色体17q21的HOXB簇中间,miR-196-2位于染色体12q13的HOXC簇的HOXC9与HOXC10之间等。miR-196对HOX基因簇中平行进化基因HOXB8、HOXC8和HOXD8的遗传信息具有进化保守的互补性,可介导HOXB8和HOXC8表达缺失。Chen等将miR-130a结合于HOXA5的3’-UTR后,下调HOXA5的表达,从而促进血管生成过程。DNA甲基化(DNA methylation)是目前研究得最多的表观遗传学内容,是指在生物体内DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, DNMT)催化甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethioni, SAM)提供一个甲基结合到CpG二核苷酸中的胞嘧啶变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程,不仅在基因表达调控、细胞增殖、分化发育及基因印迹等方面起着重要作用,而且与肿瘤的发生发展关系密切。HOX基因的甲基化在多种肿瘤中都有发生,越来越多的研究发现在肺癌中的基因甲基化的存在,但在SCLC耐药过程中基因的甲基化尚未见报道。目的比较SCLC多药耐药细胞株(H69AR)和敏感细胞株(H69)中基因表达差异,选取HOX基因家族中表达差异显著的成员进行研究,分析其对SCLC耐药性的调控作用,以及miRNA和DNA甲基化对HOX基因的调节作用,进一步丰富SCLC多药耐药性的分子机制,为临床治疗提供理论依据。内容与方法一、分析SCLC多药耐药细胞株H69AR和敏感细胞株H69中HOXA1基因表达差异性以SCLC多药耐药细胞株H69AR和敏感细胞株H69作为研究对象,采用cDNA基因芯片分析两株细胞中具有差异表达的基因,选取HOX家族中表达差异显著的HOXA1,采用实时荧光定量PCR和Western Blot技术验证HOXA1的mRNA和蛋白在两株细胞中的表达差异；二、HOXA1表达对小细胞肺癌多药耐药性的影响采用HOXA1表达质粒和siRNA增加或降低SCLC多药耐药细胞株H69AR和敏感细胞株H69中HOXA1表达水平,CCK8法分析细胞对小细胞肺癌常用化疗药物顺铂(Cisplatin, DDP)、足叶乙甙(Etoposide, VP-16)及阿霉素(Doxorubicin, ADM)敏感性的变化,流式细胞术分析细胞凋亡和周期的变化；三、H69AR和H69细胞中miR-100表达差异性采用miRNA芯片分析两株细胞中microRNA表达差异,利用miRNA靶基因分析软件(miRanda、TagetScan和PicTar)分析HOXA1相关miRNA,选取表达差异显著的miR-100进行研究,实时荧光定量PCR技术验证miR-100的表达差异。四、miR-100对HOXA1的靶向调节作用1、采用miR-100抑制物(inhibitor)和模拟物(mimic)抑制或增加H69AR和H69细胞中miR-100的表达水平,实时荧光定量PCR和Western Blot技术分析HOXA1mRNA和蛋白水平的变化。2、构建HOXA13’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)的psiCHECK-2荧光素酶载体(psiCHECK-2-HOXA1-3’UTR),与miR-100mimic或inhibitor共转染H69AR细胞,采用双荧光素酶报告基因测定方法检测HOXA1荧光素酶活性。五、miR-100对SCLC多药耐药性的影响采用miR-100inhibitor和nimic抑制或增加H69AR或H69细胞中miR-100的表达,CCK8法分析细胞药物敏感性的变化,确定miR-100对SCLC耐药性的影响。六、HOXA1启动子区甲基化状态与SCLC多药耐药性的关系重亚硫酸盐测序PCR (bisulfit prosequencing PCR, BSP)法分析H69AR细胞和H69细胞中HOXA1启动子区甲基化状态,采用去甲基化制剂(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理H69AR细胞后分析HOXA1启动子区甲基化状态和细胞耐药性的变化。七、HOXA1在SCLC组织中的表达及临床病理意义收集63例SCLC患者石蜡包埋组织,免疫组化染色,分析HOXA1表达与SCLC患者临床特征及生存率的关系。八、HOXA1在SCLC患者血液样本中的表达收集29例SCLC患者化疗前和化疗后三个月的血液样本,采用实时荧光定量PCR法分析HOXA1mRNA表达。九、统计学分析所有结果均经SPSS13.0统计软件统计。数据以均数±标准差(x±s)表示,两株细胞间HOXA1或miR-100表达的比较采用独立样本t检验。多组间HOXA1或miR-100表达的比较采用one-way ANOVA(方差齐同时)或Welch法(方差不齐时),多重比较采用Dunnett法(方差齐同时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)。CCK-8实验结果采用析因设计资料的方差分析,多重比较采用SNK法。HOXA1表达与临床病理特征分析采用列联表资料分析。多因素对SCLC患者生存时间的影响采用逐步Cox回归模型分析,各因素对SCLC患者生存时间的影响采用Kaplain-Meier分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、HOXA1在SCLC多药耐药细胞株H69AR中的表达显著降低cDNA芯片结果显示HOXA1在SCLC细胞株H69中的表达是多药耐药细胞株H69AR中的表达的4.16倍,实时荧光定量PCR结果(6.67倍,t=13.294,P=0.005)和Western Blot检测(3.50倍,t=14.852,P<0.001)结果验证了基因芯片的结果。二、上调HOXA1的表达明显增加H69AR细胞的药物敏感性1、成功构建HOXA1表达质粒HOXA1-EGFP-N1,经测序和序列对比显示与人HOXA1编码区(coding sequence, CDS)完全一致。2、建立稳定高表达细胞株H69AR-HOXA1将HOXA1-EGFP-N1及阴性对照pEGFP-N1转染入H69AR细胞,经G418筛选后建立稳定转染细胞株H69AR-HOXA1和H69AR-eGFP,荧光定量PCR和Western Blot检测显示H69AR-HOXA1细胞中HOXA1的mRNA (5.82倍,P=0.008)和蛋白(2.13倍,P<0.001)水平显著升高。3、H69AR-HOXA1细胞对ADM. DDP和VP-16的生存率较H69AR-EGFP和H69AR细胞的生存率显著降低(P<0.001),50%抑制浓度(half maximal inhibitory concentration of a substance, IC50)亦降低。4、流式细胞术分析显示ADM、DDP和VP-16诱导的H69AR-HOXA1细胞凋亡率较H69AR-EGFP和H69AR细胞增加,而G0-G1期和G2-M期细胞数减少。三、下调HOXA1的表达显著增加H69细胞的耐药性1、HOXA1-792显著降低HOXA1在H69细胞中的表达设计合成了三对针对HOXA1的siRNA寡核苷酸,采用lipofectamin2000转染H69细胞,提取总RNA和总蛋白,实时荧光定量PCR显示转染HOXA1-792、HOXA1-372和HOXA1-238使H69细胞中HOXA1mRNA水平分别降低66%(P<0.001)、3%(P=0.003)和55%(P<0.001),Western Blot显示蛋白水平分别下降63%(P<0.001)、4%(P=0.504)和49%(P<0.001),因此采用HOXA1-792进行后续实验。2、CCK-8法分析结果显示,转染HOXA1-792的H69细胞对药物的生存率较阴性对照(negative control, NC)组和空白对照组显著增加(P<0.001),IC50值亦显著增加。3、流式细胞术分析结果显示,ADM、DDP和VP-16处理后,转染HOXA1-792的H69细胞的凋亡率较阴性对照组和空白对照组降低,G0-G1期和G2-M期阻滞。四、miR-100在SCLC多药耐药细胞株H69AR中表达显著升高miRNA芯片结果显示miR-100在SCLC多药耐药细胞株H69AR中的表达升高,是H69细胞中的6.64倍,实时荧光定量PCR结果显示miR-100在H69AR细胞中的表达是H69细胞中的表达的194.57倍(t=-31.464,P=0.001)。五、HOXA1是miR-100的靶基因1、miRNA靶基因预测软件(PicTar, TarScan和miRBase)分析显示,miR-100与HOXA13’-UTR具有互补结合位点。2、miR-100对HOXA1蛋白表达的调节作用(1)将miR-100inhibitor转染H69AR细胞后,miR-100的表达降低了79.33%(P<0.001), HOXA1蛋白水平显著升高(2.15倍,P<0.001), HOXA1mRNA水平无显著变化(P=0.146)。(2)将miR-100mimic转染H69细胞后,miR-100表达增加(8.77倍,P<0.001), HOXA1蛋白水平显著降低55%(P<0.001),HOXA1mRNA水平无显著变化(P=0.565)。3、miR-100对HOXA1具有靶向调节作用(1)成功构建psiCHECK-2-HOXA1-3’UTR-R载体通过PCR扩增HOXA13’-UTR,产物长度为1150bp,经转化、抗性筛选、挑取单克隆等步骤后试剂盒提取质粒,Not I和Xho I双酶切,产物大小约为6273bp/1133bp。酶切鉴定psiCHECK-2-HOXA1-3’UTR克隆1-4和psiCHECK-2-HOXA1-3’UTR-R克隆3正确,挑起psiCHECK-2-HOXA1-3’UTR-1号克隆和psiCHECK-2-HOXA1-3’UTR-R-3号克隆进行测序。测序结果与理论序列一致,试剂盒提取质粒进行后续实验。(2) HOXA1荧光素酶活性受miR-100mimic和inhibitor调节将psiCHECK-2-HOXA1-3’UTR-R或psiCHECK-2-HOXA1-3’UTR-mut载体与miR-100mimic或inhibitor共转染H69AR细胞,检测HOXA1荧光素酶活性显示,与miR-NC组相比,miR-100mimic可显著抑制转染HOXA13’-UTR的H69AR细胞中HOXA1荧光素酶活性(P=0.003), miR-100inhibitor可显著增加转染HOXA13’-UTR的H69AR细胞中HOXA1荧光素酶活性(P=0.006), miR-100mimic (P=0.340)和miR-100inhibitor (P=0.201)对转染HOXA13’UTR-mut的H69AR细胞中HOXA1荧光素酶活性无显著影响。六、抑制miR-100表达引起H69AR细胞的药物敏感性增加转染miR-100inhibitor的H69AR细胞对药物的生存率较阴性对照组和空白对照组显著降低(P<0.001),IC50值亦降低。七、增加miR-100表达能显著降低H69细胞对ADM、DDP和VP-16的敏感性转染miR-100mimic的H69细胞对药物的生存率较阴性对照组和空白对照组显著增加(P<0.001),IC50值亦增加。八、H69AR细胞中HOXA1启动子区甲基化率较H69细胞中增加H69细胞中HOXA1启动子区甲基化率为17.14%,H69AR细胞中HOXA1启动子区甲基化率为91.43%,提示H69AR细胞中HOXA1启动子区甲基化可能是HOXA1表达降低的机制之一。九、5-Aza-CdR对HOXA1甲基化状态和mRNA水平的影响5-Aza-CdR处理后HOXA1的启动子区甲基化率降低至20%,HOXAl mRNA水平显著升高(6.52倍,P<0.001)。十、5-Aza-CdR能增加H69AR细胞对化疗药物的敏感性采用5-Aza-CdR对H69AR进行去甲基化处理,H69AR细胞对A.DM(F=1918.852,P<0.001)、DDP (F=2815.367, P<0.001)和VP-16(F=3838.071,P<0.001)的生存率降低,IC50值降低。十一、HOXA1在SCLC组织中的表达与临床病理特征的关系HOXA1阳性表达位于胞浆,在SCLC组织中阳性表达率为46.0%(29/63)。其中HOXA1在男性患者中的阳性表达率42.0%(21/50)。在女性患者中的阳性表达率为61.5%(8/13),两者的HOXA1阳性表达率无统计学差异(χ2=1.585,P=0.208)。HOXA1在不超过56岁的患者中阳性表达率为50.0%(16/32),在56岁以上患者中阳性表达率为41.9%(13/31),两者的HOXA1阳性表达率无统计学差异(χ2=0.412,P=0.521)。HOXA1在局限期(LD)患者中的阳性表达率为55.1%(27/49),在广泛期患者中的阳性表达率为14.3%(2/14),两者的HOXA1阳性表达率具有统计学差异(χ2=7.302,P=0.007)。HOXA1在存活患者中的阳性表达率为91.7%(11/12),在死亡患者中的阳性表达率为35.3%(18/51),两者的HOXA1阳性表达率具有统计学差异(χ2=12.427,P<0.001)。十二、SCLC患者生存分析1、COX比例风险回归模型采用逐步COX回归模型分析,剔除两个变量"gender"(P=0.981)和"patient_age"(P=0.065),选入两个变量’’group"和“HOXA1",其中变量"group"的相对危险度为8.305,即广泛期患者的死亡风险是局限期患者的8.305倍(P<0.001),变量"HOXA1"的相对危险度为0.083,即HOXA1阳性表达的患者死亡风险为HOXA1阴性表达患者的0.083倍(P<0.001)。2、生存时间估计采用Kaplan-Meier法比较不同因素对患者生存时间的影响,结果发现男性患者与女性患者的生存时间无统计学差异(χ2=1.875,P=0.171)。不超过56岁的患者的生存时间显著高于56岁以上患者(χ2,4.158,P=0.041)。局限期患者的生存时间显著高于广泛期患者(χ2=55.023,P<0.001)。HOXA1阳性表达患者的生存时间显著高于HOXA1阴性表达患者(χ2=46.888,P<0.001)。十三、采用实时荧光定量PCR检测HOXA1在29例SCLC患者化疗前后血液样本中的表达,发现24例患者化疗后的血液样本HOXA1表达较化疗前升高,5例患者化疗后的血液样本中HOXA1表达较化疗前降低。结论1、HOXA1在SCLC多药耐药细胞株H69AR中表达降低,增加或降低细胞中HOXA1表达可以引起细胞的耐药性变化,表明HOXA1参与了SCLC的多药耐药。2、miR-100在SCLC多药耐药细胞株H69AR中表达升高,降低或增加miR-100表达可以引起细胞的药物敏感性变化,HOXA1是miR-100的靶基因之一,表明miR-100参与了对HOXA1的表达调控及SCLC的多药耐药过程。3、H69AR细胞中HOXA1启动子区甲基化率升高,去甲基化处理引起HOXA1甲基化率降低以及H69AR细胞耐药性降低,表明启动子区甲基化状态也参与了对HOXA1的表达调控及SCLC的多药耐药过程。4、HOXA1在SCLC组织中的阳性表达与患者的分期和生存时间有关,可以作为SCLC患者的临床预后指标。