目的:胶质母细胞瘤（Glibioblastoma,GBM）是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤。在GBM进展和复发过程中,间充质亚型GBM被认为是可由其它分子亚型转化而来的、最为稳定且免疫微环境最为复杂的GBM分子亚型。间充质亚型特征明显的GBM具有强于其它分子亚型的侵袭性能及抗药能力,是导致传统治疗方案如放疗联合替莫唑胺化疗失败的主要原因。鉴于GBM的分子亚型特征的转化是对肿瘤内在因素如基因变异的累积和表观遗传的异常、以及外在因素如治疗压力的动态反映,阐明导致间充质亚型转化的相关因素及调控机制,并致力于弱化该种难治性表型特征,将为治疗GBM提供有临床转化价值的新方法和新策略。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）作为占据近一半GBM组织细胞总量的肿瘤免疫相关细胞,参与调控了GBM的多种恶性病理进程。研究表明免疫抑制型TAMs具备增强肿瘤细胞间充质特征的能力,而间充质亚型GBM又是以其强大的募集TAMs的特性被熟知,因此,在TAMs与间充质亚型GBM细胞之间,存在互相促进彼此恶性表型的紧密联系,这种互作关系会不断强化GBM的间充质亚型特征,导致GBM的恶性进展。然而,迄今为止,关于TAMs与GBM细胞互作关系的研究尚不充分,TAMs与间充质亚型GBM间的分子调控网络及其运行机制需要更深入的探究。研究方法:1.明确间充质亚型GBM微环境特征:分析来自CGGA和TCGA数据库转录组学数据的GBM患者。GSVA、ss GSEA和CIBERSORT估算法综合评估肿瘤微环境内免疫细胞富集程度及构成比例。2.证实TAMs浸润与间充质亚型GBM密切相关并寻找两者间的关键调控分子:使用Verhaak GBM分子亚型聚类方法、MSig DB数据库查找获得的间充质亚型标志性基因集评分,以及间充质亚型标志物表达水平数据,在CGGA和TCGA数据库中验证间充质亚型GBM和巨噬细胞浸润间的相关性,同时用GBM患者病理组织进行组化染色验证。3种GBM表达谱数据联合筛选出既在间充质亚型GBM中特异性高表达,又与TAMs富集程度显著相关的具备独立预后价值的促癌基因。最终筛选得到可能介导TAMs与间充质亚型GBM间相互作用的、编码趋化素蛋白的关键基因维甲酸受体反应蛋白2（Retinoic acid receptor responder protein 2,RARRES2）。3.利用TCGA和CGGA数据库及单细胞测序数据分析RARRES2的临床表达特征及来源细胞类型,并通过Real-time PCR、ELISA、免疫组化及流式细胞术等方法确认其在胶质瘤患者病理组织中的表达情况。4.使用慢病毒构建稳定过表达或敲低趋化素的原代GBM细胞,通过表达谱测序、迁移侵袭实验、Real-time PCR及Western blotting证实肿瘤细胞分泌的趋化素可通过自分泌作用方式,增强肿瘤细胞间充质特性。5.利用Real-time PCR、免疫共沉淀及Western blotting技术证实趋化因子样受体1（Chemokine-like receptor,CMKLR1）为趋化素的主要作用受体,且趋化素能抑制CMKLR1的蛋白酶体降解途径从而增加CMKLR1在GBM细胞中的表达水平。6.在TAMs-GBM细胞共培养体系下进行阻断或恢复实验,通过Real-time RCR、流式细胞术、Western blotting及迁移实验明确GBM来源的趋化素可通过旁分泌方式影响TAMs的浸润能力、极化状态及其对肿瘤细胞间充质特征的增强效应。7.使用Western blotting证实趋化素可通过NF-κB通路调控GBM的间充质特征。8.利用GBM原位种植瘤模型,通过生存分析、HE染色、流式细胞术、免疫组化、Real-time PCR及Western blotting等技术方法,进一步证实趋化素作为预后不良因素可强化肿瘤组织间充质特征、促进M2型巨噬细胞肿瘤内浸润,加速GBM进展。而使用CMKLR1受体活化抑制剂2-（α-naphthoyl）-ethyltrimethylammonium iodide（α-NETA）阻断趋化素/CMKLR1轴可消除趋化素的促瘤作用,为间充质亚型GBM治疗提供了新策略。结果:1.TAMs富集水平与GBM间充质特征呈正相关:结合免疫细胞基因集评分及GBM分子亚型分类情况发现,间充质亚型GBM免疫微环境最为复杂,并以非活化的M0状态或免疫抑制的M2状态的TAMs显著富集为主要特点。巨噬细胞的富集评分与间充质亚型基因集评分及间充质标志物表达水平呈正相关,并可通过巨噬细胞的富集程度预测GBM的间充质表型。2.趋化素可能在TAMs与间充质亚型GBM的相互作用中发挥关键作用:通过基因筛查我们发现,RARRES2编码合成的趋化素是具有独立预后价值的、既与TAMs浸润程度正相关也在间充质亚型GBM中高表达的关键分子。3.趋化素主要表达于间充质特征较明显的GBM细胞:与低级别胶质瘤患者相比,GBM患者肿瘤组织及外周血中,趋化素m RNA水平和蛋白水平均显著升高。高表达趋化素的GBM患者,其总生存时间缩短,且肿瘤组织间充质特征显著。单细胞测序数据及流式细胞术分析显示,在GBM组织中趋化素主要表达于间充质特征评分较高的肿瘤细胞。与正常人星形胶质细胞及间充质特征不明显的GBM细胞相比,间充质特征明显的原代GBM细胞具有更高的趋化素分泌水平。4.GBM来源的趋化素通过自分泌作用方式,增强GBM细胞的间充质特征:表达谱测序数据显示,趋化素重组蛋白刺激后的GBM细胞间充质特征更加明显。过表达趋化素的GBM细胞,其迁移和侵袭能力明显增强,间充质标志物的表达水平亦显著升高,而敲低趋化素的GBM细胞的间充质特征明显减弱。5.CMKLR1在GBM细胞中介导趋化素的促间充质特征作用,且趋化素可通过抑制CMKLR1泛素化降解,提升GBM细胞CMKLR1的表达水平:作为趋化素的主要受体,CMKLR1在间充质亚型GBM中高水平表达,且趋化素的预后价值只适用于高表达CMKLR1的GBM患者。通过敲低肿瘤细胞中可能传导趋化素信号的其它两种受体G protein-coupled receptor-1（GPR1）和Chemokine receptor-like 2（CCRL2）发现,CMKLR1才是介导趋化素促GBM细胞间充质特征的关键受体。而过表达或敲低趋化素,可分别抑制或增加GBM细胞CMKLR1的K48/K27泛素活性位点的泛素化水平,从而增加或降低CMKLR1的表达水平。6.GBM来源的趋化素通过旁分泌作用方式,促进TAMs的浸润能力及M2极化,同时增强TAMs对GBM间充质特征的效应功能:TAMs是肿瘤组织中CMKLR1表达水平最高的髓系细胞群,且高表达趋化素的GBM患者,其肿瘤组织内TAMs的浸润亦十分丰富。过表达趋化素可增加GBM细胞募集TAMs的能力,并诱导其向M2极化。而敲低趋化素的GBM细胞的检测结果与此相反。阻断趋化素/CMKLR1轴可消除过表达趋化素对TAMs的作用效果。采用两步共培养体系发现,与过表达趋化素的GBM细胞共培养后,TAMs的促进GBM细胞间充质标志物表达的能力明显增强,而敲低趋化素会减弱TAMs促GBM细胞间充质化的能力。7.趋化素通过正向调控GBM组织间充质特征和TAMs浸润,促进GBM体内进展:过表达趋化素可明显缩短GBM原位荷瘤鼠生存时间,促进肿瘤生长。组织学检查显示,过表达趋化素的荷瘤鼠,其肿瘤组织间充质特征及TAMs浸润十分显著。8.趋化素通过激活NF-κB通路强化GBM细胞间充质特征及改变TAMs生物学功能:原代细胞表达谱测序数据及GBM患者公共数据库数据分析显示,趋化素与NF-κB通路的活化显著相关。趋化素可时间依赖性增加GBM细胞NF-κB通路的活化。抑制NF-κB通路活化可逆转过表达趋化素的GBM细胞的间充质特征增强现象。同时,与过表达趋化素的GBM细胞共培养的TAMs细胞,其NF-κB通路也明显活化,提示趋化素亦可通过NF-κB通路参与调控TAMs功能。9.抑制趋化素/CMKLR1轴可减弱GBM间充质特征并延长GBM荷瘤鼠生存期:体外通过中和趋化素、敲低CMKLR1及使用CMKLR1受体活化抑制剂α-NETA,可以有效减弱过表达趋化素所增强的GBM间充质特征,并减少TAMs的浸润及M2极化。体内通过腹腔注射α-NETA,可显著抑制过表达趋化素GBM的生长,延长原位荷瘤鼠生存时间,并降低GBM组织间充质特征及NF-κB通路的活化。α-NETA处理亦可显著降低TAMs的浸润,提高M1亚型TAMs的比例。此外,在α-NETA治疗后的肿瘤免疫微环境中,CD8+及CD4+T细胞的IFN-γ及TNF-α分泌水平显著增加,而PD-1表达显著减少。这些实验结果表明靶向趋化素/CMKLR1轴可有效抑制趋化素介导的GBM间充质特征增强作用,改善GBM抗肿瘤免疫微环境。结论:GBM来源的趋化素可通过自分泌及旁分泌作用方式,强化GBM-TAMs互作调控网络,增强GBM间充质特征。靶向趋化素/CMKLR1轴可消除趋化素对GBM间充质特征的增强效应,有效抑制GBM的进展。