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目的:老年人随着年龄的不断增长,身体机能也在不断的下降,尤其是绝经后的女性。由于卵巢功能的衰退,身体内雌性激素水平偏低,从而引起了一系列的代谢疾病。骨骼肌萎缩是较常见的一种疾病,临床上表现为骨骼肌功能的衰退和质量的下降。这增加了跌倒和骨折的风险,大大的增加了发病率和死亡率,让绝经后女性的生活质量不断的下降。如何预防雌激素减少诱发的骨骼肌萎缩是临床上亟待解决的问题。抗阻力运动是改善骨骼肌萎缩的一种较有效的运动方式,可以有效的刺激骨骼肌,改善骨骼肌的代谢,使骨骼肌肥大,但是关于抗阻力运动改善骨骼肌萎缩的作用机制尚不明确。低强度脉冲超声(Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是一种方便、安全、无创伤的治疗手段,其如此多的优点让它备受关注,已经有研究显示LIPUS对运动损伤的治疗有较好的效果,但其对骨骼肌萎缩的治疗并没有被广泛的研究。Myostatin(MS FN)是生长分化因子8,运动能够抑制MSTN的表达,激活下游关键分子Akt,抑制FoxO1,激活mTOR,促进蛋白质合成,使骨骼肌肥大。然而有关抗阻力运动和LIPUS对绝经后骨骼肌萎缩改善效果的研究较少。本实验探讨了负重爬梯运动和LIPUS联合干预对去势大鼠骨骼肌萎缩的改善效果及分子机制,为雌激素减少诱发的骨骼肌萎缩预防提供理论依据。方法:本实验采用健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠68只,体重220-240 g,3月龄,随机分组为:去势组(Ovariectomized,OVX)和假手术组(Sham Operation,Sham),Sham组大鼠卵巢不切除,只会切掉卵巢旁同等体积的脂肪,OVX组大鼠的卵巢都会切掉。去除卵巢手术后,将大鼠安静饲养2 w,待其伤口恢复后将OVX组随机分为:去势对照组(Ovariectomized,OVX),去势超声干预组(Ovariectomized+Ultrasound,OUS),去势负重爬梯组(Ovariectomized+Exercise,OEX),去势负重爬梯和 LIPUS 联合干预组(Ovariectomized+Exercise+Ultrasound,OEU)。使用实验室自主专利产品爬梯,高度是1m,坡度85°,每级台阶跨距2 cm,对OEX、OEU组大鼠实施6 d/w,连续10 w的递增负荷爬梯运动进行干预,10 w后对OUS组和OEU组进行LIPUS治疗干预,20 min/d,6d/w,连续3w,低强度脉冲超声仪器强度为30 mW/cm2,频率为1.5 MHz,占空比为20%,脉冲频率为100 Hz。10 w后从Sham组和OVX组随机取7只大鼠,OEX组随机取7只大鼠,取材后将血清和组织保存等待检测,13 w后将剩余大鼠全部取材。记录并检测各组大鼠的生理、生化指标,其中包括:体重、抓力、骨骼肌重量,肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、骨骼肌糖原,使用RT-qPCR(Quantitative Real-time PCR)和Western Blot从基因水平、蛋白水平检测MSTN/Akt信号通路相关信号分子的表达,来分析负重爬梯运动和LIPUS对去势大鼠股四头肌萎缩的改善效果及分子机制。在细胞水平探究LIPUS和机械牵拉对成肌细胞的作用。采用机械牵拉和LIPUS对成肌细胞进行干预,机械牵拉的干预分4组:正常组,1000 μstrain组、2000 μstrain组和4000μstrain组,干预频率为0.5 Hz,时间为1 h。LIPUS的干预分为4组:正常组,10mW/cm2组,30mW/cm2组、75 mW/cm2组,干预时间为20 min/d,持续3d。本实验会重点使用流式细胞仪,为了检测细胞的增殖情况,会用这个仪器得到细胞周期,根据相应的公式能够算出细胞增殖指数。结果:1.大鼠生理指标结果:10 w的爬梯运动后,与Sham组大鼠相比,OVX组大鼠的体重极显著增加(P<0.01)、抓力明显变小(P<0.05)、股四头肌重量显著减轻(P<0.05),OEX组大鼠的体重极明显增加(P<0.01)、抓力极显著变大(P<0.01);与OVX组大鼠相比,OEX组大鼠的体重明显减小(P<0.05)、抓力极明显变大(P<0.01)、股四头肌重量显著增加(P<0.05)。3w的LIPUS照射后,与Sham组大鼠相比,OVX、OUS、OEX、OEU组大鼠的体重极显著增加(P<0.01),抓力极明显减小(P<0.01),OVX组大鼠的股四头肌重量极显著减小(P<0.01);与OVX组大鼠相比,OUS、OEX、OEU组大鼠的股四头肌重量极显著增加(P<0.01)。2.大鼠生化指标结果:10 w的爬梯运动后,与Sham组大鼠相比,OVX组大鼠的血清LDH含量明显上升(P<0.05)、股四头肌糖原含量明显下降(P<0.05);与OVX组大鼠相比,OEX组大鼠的血清LDH含量明显下降(P<0.05)、血清CK含量明显下降(P<0.05)、股四头肌糖原含量明显上升(P<0.05)。3w的LIPUS照射后,与Sham组大鼠相比,OVX组大鼠血清LDH含量极显著增加(P<0.01),OUS、OEX组大鼠的LDH含量明显增加(P<0.05),OVX组大鼠血清CK含量极显著增加(P<0.01),OUS、OEX组大鼠的CK含量明显增加(P<0.05),OVX、OUS组大鼠股四头肌糖原含量极显著减少(P<0.01),OEX组大鼠股四头肌糖原含量明显减少(P<0.05);与OVX组大鼠相比,OEU组大鼠血清LDH和CK含量都明显减少(P<0.05),OEX组大鼠股四头肌糖原含量明显增加(P<0.05),OEU组大鼠股四头肌糖原含量极显著增加(P<0.01);与OUS组大鼠相比,OEX组大鼠股四头肌糖原含量明显增加(P<0.05),OEU组大鼠股四头肌糖原含量极显著增加(P<0.01)。3.MSTN及其受体介导胞内Akt及下游信号分子表达结果:10 w的爬梯运动后,与Sham组大鼠相比,OVX组大鼠股四头肌MSTN、ActRIIB、FoxO1的mRNA和蛋白表达都显著上升,Akt、p-Akt、mTOR蛋白表达都显著降低,mTORmRNA表达显著降低;与OVX组相比,OEX组大鼠股四头肌MSTN、ActRIIB、FoxO1的蛋白表达显著下降,MSTN、FoxO1mRNA表达显著下降,Akt、mTOR蛋白表达都显著上升。3 w的LIPUS照射后,与Sham组大鼠相比,OVX组大鼠股四头肌 MSTN、ActRIIB、FoxO1 的 mRNA 和蛋白表达都显著上升,Akt、p-Akt、mTOR的mRNA和蛋白表达都显著降低;与OVX组相比,OUS、OEX、OEU组大鼠股四头肌MSTN、ActRIIB、FoxO1的蛋白表达都显著降低,OUS、OEX组大鼠股四头肌MSTN、ActRIIB、OEU组大鼠股四头肌FoxO1的mRNA表达显著降低,OEX、OEU组大鼠股四头肌Akt、p-Akt、mTOR蛋白表达都显著上升,OUS组大鼠股四头肌Akt、mTOR蛋白表达都显著上升。两种干预方式联合对ActRIIB、p-Akt、mTOR蛋白表达的效果优于单一干预方式。4.成肌细胞增殖的结果:低强度脉冲超声干预成肌细胞的增殖情况,与NC组相比,10mW/cm2、30mW/cm2组增殖水平明显增加(P<0.05,P<0.01);与10 mW/cm2组相比,30 mW/cm2组增殖水平明显增加(P<0.05);与30 mW/cm2组相比,75 mW/cm2组增殖水平极显著下降(P<0.01)。机械牵拉干预成肌细胞增殖情况,与NC组相比,1000 distrain、2000 distrain组增殖水平极显著增加(P<0.01);与1000 ystrain组相比,2000 distrain组增殖水平极明显增加(P<0.01),4000 distrain组增殖水平极明显下降(P<0.01);与2000 distrain组相比,4000 ystrain组增殖水平极明显下降(P<0.01)。结论:1.爬梯运动能够有效抑制去势导致的大鼠体重增加、抓力变小和股四头肌重量减轻,在运动停止3 w后,股四头肌重量增加的效果仍持续存在。LIPUS干预能够明显缓解去势导致的股四头肌重量减轻。2.爬梯运动、低强度脉冲超声干预以及两种联合干预对去势导致的股四头肌萎缩均有改善作用,其机制可能通过调控MSTN/Akt信号通路,抑制MSTN表达,介导Akt下游FoxO1和mTOR途径促进蛋白质的合成,来缓解去势大鼠股四头肌的萎缩。从几种不同方式干预分析看,爬梯运动的治疗效果要优于LIPUS干预的治疗效果,且两种方式联合干预对去势导致的股四头肌萎缩的治疗效果要优于单一方式的治疗效果。3.2000 μstrain机械牵拉与30mW/cm2LIPUS促进成肌细胞增殖的效果最优,从体外实验进一步解释了牵拉与LIPUS改善骨骼肌功能的细胞机制。