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目的:淋巴细胞的抗原受体发生等位基因排斥,又称单等位基因表达,来自父方和母方的抗原受体等位基因在成熟的淋巴细胞中只有一个表现活性。B淋巴细胞单等位基因表达抗原受体(BCR)是通过沉默两个同源抗原受体之一完成,如果没有等位基因排斥,相同的B细胞将产生两个不同的重链和4个不同的轻链(两个kappa,两个lambda),假定不同的重链和轻链独立互相结合,可以产生30种不同的异4聚体,不利于抗体对抗原的识别,而等位基因排斥保证表达有效的多价抗体分子,保证一个B细胞仅产生一种BCR。等位基因排斥似乎是一种普遍的表观遗传现象,嗅神经受体等位基因排斥保证嗅觉识别的精确性,X染色体失活保证染色体环境的平衡,均发挥重要的生物学作用。这些现象自上世纪60年代发现以来一直是积极研究的课题,但是至今仍然不能明确其发生机理。
几十年来,研究者将大部分注意力集中在编码蛋白质的基因和蛋白质上,随着人和小鼠基因组测序工作的完成和多细胞真核生物基因表达调节资料的积累,研究热点已经转移到非编码序列(包括重复序列),非编码DNA中包含着重要的有关生物发育和生理的遗传资料。蛋白质在等位基因排斥中的作用已经有一些文献报道,涉及的蛋白质有NFкВ转录复合物等转录调节因子,转录因子结合在启动子部位,促进基因表达。但是这些转录因子并不是T,B细胞特异的,其他基因也使用这些转录因子,显然还有起作用的其他的环节。典型的等位排斥基因(VH,Vκ,Vλ,TCRβα,TCRδ,TCRβ,TCRγ,嗅神经受体)都有多个同源基因成簇分布的倾向,如VH基因簇有约100个VH基因片段串连;人的X染色体有30％的Line-1重复序列,而其他染色体只有15％的Line-1分布。生物信息学分析发现,单等位表达基因及其侧翼含有更多的Line-1。这些发现提示,相同或类似序列成簇分布(即重复序列成簇分布)的基因组学特征可能与等位基因排斥存在关联,这是需要用实验进一步验证的科学问题,但是目前对于成簇分布的基因组学特征在等位基因排斥方面所起的作用缺乏研究。根据基因组学的发现,等位排斥基因均有重复序列成簇分布的倾向,TCR,BCR,嗅神经受体等位基因排斥和X染色体失活可能有相同的基础。
TCR,BCR和嗅神经受体等位基因排斥,不仅表现在等位基因,而且也表现在非等位的同类基因,和顺式排列(cis)的同类基因,例如BCR的κ链和λ链,尽管不是等位基因也发生排斥;1000多个嗅神经受体成簇分布在基因组的多条染色体上,只有一个可以表达。所以说,等位基因排斥过程中即对同源染色体的等位基因发挥作用,也对非同源染色体的同类基因发挥作用,还对顺式排列的同类基因发挥作用。
本研究室的前期工作发现,Line-1和Alu重复序列以串联形式插入质粒的GFP基因下游显著抑制GFP基因表达,在GFP基因和插入的串联序列之间插入SV40PolyA可以解除串联序列对基因表达的抑制作用。这就提出以下问题:SV40PolyA中的何种序列活化基因,这些活化基因的序列如果串联之后活化基因作用增强还是减弱,活化基因的序列中核心序列是什么。抑制基因的序列随串联拷贝数增加,抑制基因的作用上升,活化基因的元件如果串联长了会对基因表达产生何种影响?用实验回答这些问题对于认识等位基因排斥会有帮助。
方法:1、合成引物和作为模板的DNA片段委托DNA合成公司合成带适当酶切位点的引物,合成带有不同突变位点或突变部位的DNA片段作为模板。表1为本论文所使用的人工合成寡核苷酸序列及其名称。
2、表达载体构建用带有合适酶切位点的引物,PCR扩增目的片段,目的片段包括质粒中的DNA序列和合成的DNA片段,酶切后插入pEGFP-C1质粒,获得插有一个片段的表达载体,利用Xba I/Nhe I酶切位点可以用T4 DNA连接酶连接,但是连接以后的位点不能被其中的任何一个酶切断的特性制备同向二串联体。
3、细胞转染和荧光观察将表达载体用LipofectamineTM2000瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下计数观察GFP荧光阳性细胞数。
4、Northern杂交用9N随机引物和大肠杆菌DNA聚合酶大片段,将α-32P-dCTP掺入DNA中制备GFP探针。提取转染细胞总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,将RNA转移到尼龙膜。32p标记的GFP探针杂交、冲洗后通过放射自显影记录实验结果。然后,这种杂交过的尼龙膜用剥离液处理,去除32P-GFP探针,用检测neo RNA的探针再次杂交,放射自显影作为转染效率的对照。扩增GFP和Neo模板的引物见表1。
结论:1、PolyA正、反序列均可以解除Alu14对GFP基因的抑制作用;将PolyA反序分成60bp一段,其中中间的两段即2F2R和3F3R可以活化基因,两端的两段没有活化基因作用。
2、2-4个2F2R拷贝活化基因作用最强,超过以后随串连拷贝数增加活化基因作用下降。
3、2个3F3R拷贝活化基因作用最强,超过以后随串连拷贝数增加活化基因作用下降,与2F2R的趋势相同。
4、对3F3R进行碱基删减分析,发现从3F3R上游算起第9个碱基到第41碱基的序列包含活化基因的核心序列(5-ATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATT)。