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第一部分转基因大鼠模型建立及其对糖尿病大鼠勃起功能的影响[目的]鉴定转基因大鼠体内hKLK1基因的存在及表达情况。构建糖尿病大鼠模型,从整体水平评估hKLK1对糖尿病大鼠勃起功能的影响。[方法]纯合型转基因大鼠TGR(hKLK1)由德国Max-Delbruck-Center for Molecular Medicine所馈赠。转基因大鼠的构建过程是在小鼠金属硫因蛋白启动子控制下将一段5.6 kb含有完整hKLK1基因的DNA片段显微注射入SD大鼠卵细胞中,经过northern blot杂交鉴定及多代筛选获得遗传稳定的纯合型转基因大鼠。获得的TGR(hKLK1)按雌雄比例3:1进行交配繁殖,子代出生后取鼠尾组织提取基因组DNA并通过PCR检测hKLK1基因的存在性。采用给空腹SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(60mg/kg)的方法构建糖尿病大鼠模型,定期检测血糖。40只SD大鼠随机分为5组(每组8只):野生正常组(WTR),转基因正常组(TGR),野生糖尿病组(WTDM),转基因糖尿病组(TGDM),转基因糖尿病+HOE140组(TGDMH)。造模12周后采用电刺激海绵体神经法检测各组大鼠海绵体内压(ICP)以及平均动脉压(MAP),计算ICP/MAP峰值、ICP曲线下面积(AUC)/MAP来评估阴茎勃起功能。收集阴茎海绵体组织,在DNA、mRNA和蛋白水平再次验证hKLK1基因。[结果]鼠尾DNA鉴定示全部转基因大鼠均含hKLK1基因,而野生型大鼠不含该基因。STZ注射后,空腹血糖高于16.7mmol/L的糖尿病大鼠在12周后血糖仍增高,体重降低。电刺激海绵体神经检测ICP结果显示:相对于正常组大鼠,WTDM组ICP/MAP峰值和AUC/MAP均显著降低,而TGDM组比WTDM组比值明显升高,接近正常大鼠水平。注射HOE140抑制hKLK1通路后,TGDMH组相对于TGDM组大鼠勃起功能显著减低。仅转基因大鼠的阴茎海绵体内含有稳定表达的hKLK1基因。[结论]转基因大鼠模型及糖尿病ED大鼠模型稳定可靠。hKLK1基因的表达可显著改善糖尿病ED大鼠的阴茎勃起功能。第二部分hKLK1对糖尿病大鼠阴茎海绵体组织的影响及机制[目的]在组织水平探索hKLK1对糖尿病ED大鼠发挥勃起功能保护作用的机制。[方法]在阴茎组织切片中用免疫组化法检测CD31和α-SMA以评估内皮和平滑肌定位与含量;从冻存的阴茎组织提取蛋白,检测PI3K,AKT,eNOS蛋白表达及其磷酸化水平;检测NOS活性、NO及cGMP释放水平;检测PDE5及离子通道BKCa、ICa-L蛋白表达;检测Rho激酶蛋白表达;检测晚期糖基化终产物受体(RAGE),NADPH氧化酶相关蛋白NOX2,phox-P67,phox-P47的蛋白表达;脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)含量来评估组织氧化应激水平;检测各组样本中凋亡相关蛋白Caspase3及其裂解蛋白、Bax、Bcl-2的水平;TUNEL染色法检测阴茎海绵体内凋亡细胞的情况;免疫组化法检测阴茎组织切片中TGFβ1定位及表达;Masson染色法检测海绵体内平滑肌与胶原的比例。Western blot法检测各组样本中TGFβ1,smad2/3及其磷酸化水平,CTGF,Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白的含量。[结果]相对于血糖正常的大鼠,野生糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中内皮和平滑肌含量降低,PI3K、AKT、eNOS蛋白水平降低,eNOS在Ser1177位点磷酸化水平降低,Thr495位点磷酸化水平升高共同导致eNOS活性降低。下游NOS活性、NO和cGMP含量降低,PDE5表达升高,离子通道BKCa蛋白表达降低,ICa-L表达升高。RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表达升高。同时,RAGE含量增高,NADPH氧化酶业基及MDA水平升高而SOD降低。凋亡相关蛋白表达及凋亡细胞比例升高。纤维化相关检测显示阴茎海绵体组织内TGFβ1-smad2/3-CTGF-collagen Ⅳ通路激活,平滑肌/胶原比例降低。TGDM组大鼠相对于WTDM组以上指标均有所改善,然而,上述指标的改善作用可被hKLK1-B2R通路的抑制剂HOE140所抵消。[结论]hKLK1基因的表达可激活糖尿病大鼠阴茎海绵体内PI3K-AKT-eNOS-NO-cGMP通路,抑制RhoA-ROCK通路,抑制组织内氧化应激、凋亡及纤维化的形成,从而改善糖尿病性ED大鼠的勃起功能。第三部分hKLK1对大鼠内皮细胞及阴茎海绵体平滑肌细胞的影响[目的]在细胞水平探索hKLK1对大鼠阴茎海绵体内皮细胞和平滑肌细胞的影响。[方法]用组织块法及差速贴壁法原代培养及纯化阴茎海绵体平滑肌细胞;用胶原酶消化法配合基质胶原代培养主动脉内皮细胞。免疫荧光法用α-SMA和desmin鉴定平滑肌细胞,用vWF及CD31鉴定内皮细胞,并鉴定内皮细胞内hKLK1基因的表达。内皮细胞与平滑肌细胞共培养,在transwell小室中分别加入hKLK1的底物低分子量激肽原(LMWK),以及 B2R、PI3K、eNOS 的抑制剂 HOE140、LY294002、L-NAME,检测海绵体平滑肌细胞内cGMP含量及钙离子浓度。内皮及平滑肌细胞分别使用低糖5 mM或高糖30 mM培养,加入LMWK或HOE140培养3 d后,在海绵体平滑肌细胞内用ELISA检测cGMP含量,用Western blot检测高糖培养对Rho激酶、NOX2,Bax,Bcl-2蛋白水平的影响,以及对ROS含量及细胞凋亡的影响。[结果]成功培养出原代海绵体平滑肌细胞及主动脉内皮细胞。来源于转基因大鼠的内皮细胞表达hKLK1。共培养体系中在加入hKLK1的底物LMWK后,野生及转基因海绵体平滑肌细胞cGMP含量均增高,钙离子浓度均下降,且在转基因组变化更大。但在加入HOE140、LY294002、L-NAME后,这两项指标的变化程度都受到一定的抑制。高糖环境下,阴茎海绵体平滑肌细胞内cGMP含量降低,RhoA、ROCK1、ROCK2、NOX2表达增高,ROS含量增高,凋亡相关蛋白增高(Bax/Bcl-2比值增高),凋亡细胞比例增高;而含有hKLK1基因的平滑肌细胞上述指标变化减轻,但HOE140处理后hKLK 1的保护作用消失。[结论]hKLK1可裂解LMWK,其产物通过结合B2R,激活内皮细胞内PI3K-eNOS通路,引起平滑肌细胞内cGMP含量增高及钙离子浓度降低,从而促进平滑肌舒张。高浓度葡萄糖可在细胞水平造成海绵体平滑肌细胞内cGMP含量降低,RhoA-ROCK通路激活、氧化应激及细胞凋亡水平增高,hKLK1不仅维持了海绵体平滑肌cGMP水平,抑制了 RhoA-ROCK的活化,还对细胞氧化应激损伤及凋亡起到保护作用。