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p53蛋白是一种由p53肿瘤抑制基因编码的蛋白质,主要分布在细胞核浆中,与细胞周期的调控、DNA修复和细胞凋亡等重要的生命活动息息相关。p53蛋白作为一种转录因子,能与其下游基因的蛋白识别位点特异性结合,调控多种下游基因的表达,进而维持细胞的正常状态。在癌症中,许多下游基因启动子区域上的p53蛋白结合位点常被高甲基化,抑制了下游基因的转录。那么下游基因沉默的产生是由于甲基化直接阻碍了p53蛋白的结合还是由于那些转录抑制因子发挥作用而间接抑制了基因转录呢?为了阐明这一科学问题,在p53蛋白与甲基化/羟甲基化DNA相互作用方面开展了有益的探索。选择IGFBP-3(胰岛素样生长因子结合蛋白-3)基因启动子区上的p53蛋白结合位点序列为研究探针,并设计不同修饰的甲基化/羟甲基化探针,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析p53蛋白与不同修饰探针的结合亲和性情况。 首先,设计比较了三种p53蛋白纯化方案,最终确定选择具有较高活性的第一种方案。即构建pGEX-2T+p53重组载体并在大肠杆菌中诱导表达,采用GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签亲和层析和阴离子交换层析两步法从细菌裂解液中分离纯化出p53蛋白,所获得的目的蛋白纯度较高(90%),而且活性较好。然后,选择靶基因IGFBP-3启动子区域上的p53蛋白结合位点作为研究探针,采用聚丙烯酰氨凝胶电泳初步研究了p53蛋白与双链DNA、5mC(5-甲基胞嘧啶)DNA、5hmC(5-羟甲基胞嘧啶)DNA、5fC(5-醛基胞嘧啶)DNA和5caC(5-羧基胞嘧啶)DNA结合的强弱情况。结果表明当双链DNA修饰上5mC、5hmC、5fC和5caC时,p53蛋白与其结合的作用均减弱,5fC DNA探针的结合作用最弱,但是仍然存在p53蛋白-DNA复合物,说明上述DNA修饰并不能直接阻止p53蛋白的结合,间接说明了转录抑制因子在基因沉默方面发挥了重要作用。我们的研究首次观察到了DNA上的甲基化/羟甲基化等修饰并不足以直接抑制p53蛋白与目的基因的结合,加深了对基因沉默机理的理解。