三种蚜传病毒外壳蛋白叶绿体离体跨膜运输研究

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芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)均为世界性分布病毒,属于马铃薯Y病毒组(Potatovirus Y group),在自然条件下主要靠蚜虫以非持久性方式传播,分别是危害十字花科蔬菜、豆科作物和禾本科植物的主要病毒。本文利用RT-PCR、序列测定及分析的方法对采自南京、洪泽、姜堰自然发生的具有典型症状的青菜、大豆和玉米病样进行鉴定,南京地区青菜病样分离物NJ-TuMV-CP核苷酸序列与国内外报道的TuMV不同地区的病原分离物相比较,与印度、河北和北京地区病原分离物的同源性较低,与其他地区TuMV病原分离物同源性均在90%以上,洪泽地区大豆病样分离物HZ-SMV-CP核苷酸序列与国内外报道的SMV不同地区的病原分离物相比较,与中国的SMV-BZ病原分离物序列同源性较低,与SMV其他地区病原分离物核苷酸序列的同源性均在90%以上,姜堰地区玉米病样分离物分别扩增到其JY-SCMV-CP、 JY-HC-Pro、JY-Vpg和JY-Nib四个基因,并分别与与国内外报道的SCMV不同地区的病原分离物相比较,姜堰地区玉米病样分离物各基因的核苷酸序列MDMV、SrMV和JGMV对应的序列同源性较低,且SCMV-CP基因与泰国和美国的病原分离物的同源性较低,其余各基因与GenBank中已经登录的SCMV不同地区病原分离物的CP、HC-Pro、Vpg和NIb基因的同源性均在90%以上,证实分别为TuMV、SMV和SCMV侵染。并提纯病毒,得到TuMV、SMV和SCMV的浓度分别为:13.7mg/mL、11.68mg/mL和2.51mg/mL,病毒紫外扫描呈典型病毒核蛋白吸收峰,A260/A280值分别为1.17,1.30和1.15。利用提纯的三种病毒分别制备了3株抗血清Tul1、S21和SC31,效价各为1:512000,1:204800和1:25600。根据Banerjee等的方法,本研究建立了TuMV、SMV和SCMV的外壳蛋白叶绿体离体跨膜运输体系,分别研究了跨膜时间、外壳蛋白浓度对跨膜运输效率的影响以及CP跨膜的种属选择性。结果表明,TuMV-CP、SMV-CP和SCMV-CP分别可以快速地进入离体的青菜、大豆和玉米叶绿体中,三种病毒外壳蛋白的跨膜时间均不低于5min,跨膜时间超过15min对进入叶绿体中CP的浓度没有影响;加入跨膜体系中的外壳蛋白浓度与跨膜后进入叶绿体的外壳蛋白浓度呈正相关。参照本实验室对TMV-CP以及两种麦类土传花叶病毒CWMV-CP和BaYMV-CP勺叶绿体离体跨膜运输结果,我们发现孵育时间对叶绿体跨膜效率的影响是相同的,即超过15min,跨膜时间对进入叶绿体中CP的量没有影响;加入跨膜体系中的CP浓度与跨膜后进入叶绿体的CP量呈正相关,3种病毒能够实现跨膜的外壳蛋白最低浓度分别为54.80μg/mL,49.05μg/mL和50.20μg/mL。此研究结果为探索此类病毒的致病机制提供理论依据。
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