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巨噬细胞作为最有效的病原体清除者和炎性介质的主要来源,是机体面对感染时发挥固有免疫应答的关键效应细胞。在脓毒症时,疾病的严重程度与巨噬细胞功能障碍密切相关。生理条件下,低水平的一氧化氮(NO)可由三种不同的一氧化氮合酶(NOS)亚型合成:神经元NOS(n NOS)、内皮细胞NOS9(e NOS)以及与诱导型NOS(i NOS),而在脓毒症状态下,巨噬细胞和中性粒细胞中高表达的i NOS是NO的主要来源。脓毒症时机体将产生大量NO,过量的NO不仅影响其他炎症因子的合成与释放,促进机体炎症反应,也会导致脓毒症休克期间血管功能障碍,包括血管扩张、血管反应性低下和血管通透性增加,增加死亡率。因此目前亟需有效控制NO过量生成的药物,为脓毒症提供新的治疗策略。HDAC6作为一种独特的组蛋白去乙酰化酶,主要局限在细胞质中,通过去乙酰化及泛素化作用,调节α-tubulin、HSP90等多种非组蛋白底物及信号通路,发挥抗凋亡、抗炎与免疫调节等作用。研究表明,脓毒症患者在TNF-α和IL-1β等促炎因子作用下,i NOS表达增加,NO水平升高,而抑制HDAC6可抑制巨噬细胞TNF-α、IL-1β及IL-6等炎症因子产生。为进一步明确HDAC6对于i NOS表达与NO生成的影响,首先进行体外实验,在证实LPS可诱导HDAC6野生型小鼠腹腔巨噬细胞i NOS高表达的基础上,应用经HDAC6抑制剂处理的及HDAC6基因敲除的小鼠腹腔巨噬细胞,给予LPS刺激,观察i NOS表达及NO生成情况,并探讨所涉及的分子机制;继而进行体内实验,在小鼠个体水平上验证HDAC6基因敲除对脓毒症状态下机体NO及代谢产物生成的影响。本实验第一部分为体外细胞实验:研究HDAC6对于LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞i NOS表达与NO生成的影响及分子机制。通过LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞建立体外模型,检测到LPS可诱导HDAC6野生型小鼠腹腔巨噬细胞i NOS表达水平升高,NOS活性增强,细胞培养上清中NO代谢产物亚硝酸盐浓度升高;同时也检测到小鼠腹腔巨噬细胞内STAT1在Tyr701位点上的磷酸化水平明显升高,IRF-1合成增加。若预先应用特异性HDAC6抑制剂CAY10603干预HDAC6野生型小鼠腹腔巨噬细胞,或者直接应用HDAC6基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞,可检测到细胞内α-tubulin乙酰化程度增强,再给予LPS刺激后i NOS表达水平及NO生成均明显下降,同时STAT1 Tyr701活化及IRF-1合成也均受到显著抑制。结合以往研究结果,认为应用特异性HDAC6抑制剂CAY10603或HDAC6基因敲除,主要通过改变α-tubulin乙酰化状态间接影响STAT1的活化状态,继而影响了IRF-1的合成,从而减少了p-STAT1(Try701)与IRF-1分别在i NOS启动子区的结合,降低了i NOS的转录水平及活性。本实验的第二部分为动物实验:在动物整体水平上,探讨HDAC6对于脓毒症机体NO生成的影响。该部分实验通过利用内毒素(LPS)腹腔注射,以及盲肠结扎穿刺术(CLP)分别诱导小鼠脓毒血症模型。LPS模型组:研究采用HDAC6野生型C57BL/6J小鼠和同基因背景的HDAC6基因敲除小鼠,分别给予LPS 7.5mg/kg腹腔注射;对照组:给予等量的PBS腹腔注射。6小时后收集各组小鼠血浆、腹腔灌洗液及肺组织标本,进行相关指标检测。CLP模型组:研究仍采用HDAC6野生型C57BL/6J小鼠和同基因背景的HDAC6基因敲除小鼠;实验组进行盲肠结扎穿刺术,对照组仅进行假手术,术后16小时收集各组小鼠血浆及肺组织样本,进行相关指标检测。检测指标包括:(1)LPS模型小鼠腹腔巨噬细胞内Ace-α-tubulin与i NOS蛋白表达情况;(2)两种脓毒症模型小鼠肺组织Ace-α-tubulin,i NOS,p-STAT1及IRF-1蛋白水平;(3)两种脓毒症模型小鼠血浆中NO及NO代谢产物硝基酪氨酸浓度。研究发现,脓毒症状态下HDAC6基因敲除小鼠较HDAC6野生型小鼠相比,其腹腔巨噬细胞和肺组织内α-tubulin乙酰化水平明显升高,而i NOS表达水平明显降低,调控i NOS表达的上游信号分子p-STAT1(Try701)和IRF-1表达受到明显抑制,这与体外实验的结果是一致的;同时HDAC6基因敲除的脓毒症小鼠,其血浆中NO及硝基酪氨酸的水平均较HDAC6野生型脓毒症小鼠明显降低。此外,本实验还进行了脓毒症小鼠生存分析实验,研究发现,与HDAC6野生型脓毒症小鼠相比,HDAC6基因敲除的脓毒症小鼠的生存情况明显改善。综上所述,体外实验证实,LPS可诱导小鼠腹腔巨噬细胞i NOS过表达及NO过量生成,应用HDAC6抑制剂CAY10603后,可通过抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞内STAT1(Try701)活化及IRF-1合成,从而抑制i NOS过表达及NO过量生成;进一步应用HDAC6基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞进行实验,所得实验结论与上述一致。体内实验证实,LPS腹腔注射及CLP造模均可促进HDAC6野生型小鼠体内i NOS过表达,血浆中NO及其代谢产物过量生成;HDAC6基因敲除则可通过抑制脓毒症小鼠体内STAT1(Try701)活化及IRF-1合成,从而抑制脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞与肺组织内i NOS过表达,降低其血浆中NO及硝基酪氨酸浓度,同时改善脓毒症小鼠生存情况。体内实验及体外实验均应用HDAC6基因敲除小鼠进行,与体外实验应用HDAC6抑制剂CAY10603所得实验结果一致,证实了HDAC6抑制剂实验结果的准确性与特异性。本实验研究结果提示,应用HDAC6抑制剂或HDAC6基因敲除后,可能通过降低机体NO水平而改善脓毒症小鼠的血管舒缩功能障碍,减轻其血流动力学异常,改善预后,也为寻找脓毒症治疗的新型药物提供了方向。