目的:稀土元素（Rare Earth Elements,REEs）是元素周期表中17种特殊元素的统称,包括原子序数为57⁷1的15个镧系元素和同族的钪、钇。随着稀土元素在军事、冶金工业、石油化工、农业、生物材料和医药等方面的广泛应用,越来越多的稀土元素进入环境,机体对稀土元素的接触机会也越来越大。因此稀土元素对环境和人体健康的影响,特别是近期、远期有害效应日益受到关注。稀土元素容易在自然环境中富集,通过消化道、呼吸道等途径进入人体并在组织器官中积累,可引起肝脏、肾脏、心脏、免疫、神经、内分泌和遗传等多个系统的损害。目前稀土元素对神经系统的损害作用受到了人们的重视。流行病学调查结果显示稀土元素很可能是导致儿童智力水平下降的原因。在实验动物中也证实,稀土元素可以通过血脑屏障并在脑内蓄积,导致中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）受损和功能障碍,但其机制目前尚不确切。镧是使用最广泛的稀土元素之一。由于镧在环境介质中比较稳定,可以进入脑组织并具有较强的蓄积作用和生物学活性,故经常作为代表元素来研究稀土对神经系统的损害作用。研究表明,镧在大脑中可影响微量元素分布,促进氧化应激、干扰神经递质、Ca²⁺和酶的正常功能,导致认知功能的损害。另有研究证据表明镧可引起神经元形态和结构异常、影响中枢神经系统发育、改变神经行为、损伤学习记忆能力。这些证据都说明镧具有明显的神经毒性作用,研究其损伤学习记忆的机制,对保护人群健康具有重要的意义。小胶质细胞（Microglia,MG）是唯一永久驻留在中枢神经系统的免疫细胞,在防御有害因素所致损伤和组织修复等方面发挥重要作用,并在神经元的生理活动中起着支持、营养、保护及修护等重要功能。生理条件下,小胶质细胞一般处于静息状态,当中枢神经系统出现损伤、炎症、或受外来物刺激时迅速激活。小胶质细胞激活是脑内发生炎症反应的重要表现,激活的小胶质细胞对机体可产生保护作用,维持神经元周围微环境的稳定,如分泌细胞因子、吞噬受损细胞碎片、抵御外来抗原侵袭等。但其同时分泌的炎性介质如肿瘤坏死因子α（TNFα）和一氧化氮（NO）等也可介导急性炎性反应。当小胶质细胞释放的炎性因子数量过多时,就有可能引起或加重神经元的损伤。大量证据表明激活的小胶质细胞诱导的炎症反应在感染、缺血性脑卒中、多发性硬化、神经退行性疾病和精神障碍的病理学过程中发挥了重要作用,引起人们的广泛关注。小胶质细胞内NF-κB的活化在其诱发的中枢神经系统炎症中起着非常重要的作用。NF-κB是调控炎性因子表达水平的重要转录因子之一,活化后可迅速移位进入细胞核,与靶基因上启动子区特定位点结合,启动基因转录,调节一系列参与免疫、炎症反应的基因表达。这些炎症因子许多都具有神经毒性作用,如TNFα和IL1β等,它们能引起严重的炎症反应,并在神经变性疾病如阿尔茨海默氏症（AD）和帕金森病（PD）的发病过程中起促进作用。所以小胶质细胞过度激活及其诱发的炎症反应是中枢神经系统发生损伤的重要原因之一。本课题拟通过体内和体外试验,观察镧对小胶质细胞激活以及细胞内NF-κB信号通路的影响,揭示TNFα和IL1β等炎症因子的表达异常与神经元和学习记忆损伤间的关联,为阐明镧所致的神经毒作用机制、寻找有效防治措施提供理论和实验依据。研究方法:健康SPF级成年昆明种小鼠80只,雌雄各半,体重22²5g,饲养于温度17²3℃,相应湿度45⁵5%,12h昼夜交替的环境。饲养1w适应环境后随机分为对照组（饮用蒸馏水）、低剂量染镧组（饮用含0.25%LaCl₃的蒸馏水溶液）、中剂量染镧组（饮用含0.5%LaCl₃的蒸馏水溶液）和高剂量染镧组（饮用含1%LaCl₃的蒸馏水溶液）,每组20只动物。将雌雄小鼠按1:1合笼进行交配,次日清晨发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者记为妊娠第0 d,然后孕鼠单笼饲养并自由摄水。各组子一代小鼠自出生后分别暴露于含0、0.25%、0.5%和1.0%LaCl₃的蒸馏水溶液。子代小鼠在断乳前通过母体哺乳染镧,断乳后则自行饮水摄入相应浓度的LaCl₃溶液,至断乳后2个月。染毒结束后采用Morris水迷宫试验测定仔鼠空间学习记忆能力的变化,采用HE染色方法观察海马组织病理学变化,采用Real time PCR和免疫组织化学方法检测仔鼠海马组织小胶质细胞激活标志蛋白IBA1和细胞因子TNFα、IL1β、IL6、MCP1、iNOS的mRNA转录和蛋白表达情况。体外试验采用小鼠小胶质细胞系BV2作为研究对象,BV2细胞于DMEM高糖培养液（含10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）,37℃、5%CO₂条件下常规培养。分别以0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mmol/L LaCl₃处理细胞6、12、24、48和72h,采用MTT比色法检测BV2细胞活力。分别以0、0.05、0.1和0.2mmol/L LaCl₃处理细胞24h,采用免疫荧光方法检测IBA1蛋白表达,采用Real time PCR方法检测BV2细胞内Tnfα、Il1β、Il6、Ccl2和iNos的mRNA转录水平,采用Elisa方法检测细胞培养液中TNFα、IL1β、IL6和MCP1蛋白的含量,采用Griess方法检测细胞培养液中NO的含量。分别以0、0.05、0.1和0.2mmol/L LaCl₃处理细胞2h,分离提取细胞核蛋白和浆蛋白,免疫印记法检测细胞核蛋白中p65蛋白和浆蛋白中Phospho-IKKα/β、Phospho-IκBα和p65蛋白的表达水平,免疫荧光法检测p65蛋白在细胞内的定位情况。用100μmol/L的PDTC预处理细胞1h,再以0、0.05、0.1、0.2mmol/L的Lacl₃刺激BV2细胞2h或24h后,再次检测上述蛋白和因子的表达水平或含量变化。原代培养小鼠大脑皮层神经元,采用免疫荧光法检测NeuN蛋白进行神经元的鉴定。采用条件培养液转移法和Transwell共培养法建立BV2细胞和神经元细胞共培养模型。24h或48h后,采用Annexin V/PI原位荧光法检测神经元凋亡和坏死情况,采用Heachst染色法测定神经元凋亡率。用100μmol/L的PDTC预处理BV2细胞1h,再以0、0.05、0.1、0.2mmol/L的Lacl₃刺激BV2建立共培养模型24h或48h后,检测上述指标的变化。结果:1、镧暴露对仔鼠空间学习记忆能力的影响。Morris水迷宫定位航行试验中,LaCl₃暴露仔鼠找到水下平台的时间和游泳距离随着染镧剂量的增加而延长,与对照组相比,仔鼠寻找平台的路径表现杂乱,无目的性,用时增加,游泳距离增长。空间探索试验中,0.25%、0.50%、1.00%LaCl₃暴露组仔鼠在目标象限内的时间和穿越平台的次数显著少于对照组,搜索平台策略目的性降低,甚至很少进入目标象限,学习记忆能力降低。2、镧暴露对仔鼠体重、海马重和海马系数的影响。从0.25%LaCl₃染毒剂量开始,随剂量增加,仔鼠体重不断降低,而海马组织系数不断升高,与对照组比较具有显著差异;但LaCl₃对仔鼠的海马组织重量没有明显影响,海马组织系数升高是由仔鼠的体重降低所致。3、镧暴露对仔鼠海马神经元损伤的影响。HE染色结果发现,随着镧暴露剂量的增加,大脑海马组织CA1和CA3区神经元排列紊乱、无序,细胞间隙变大,发生了不同程度的损伤。4、镧暴露对小胶质细胞活化的影响。体内和体外试验发现LaCl₃能够刺激小胶质细胞IBA1蛋白表达上调,小胶质细胞发生活化。5、镧暴露对NF-κB信号通路活化的影响。体外试验结果显示LaCl₃暴露后BV2细胞浆中p-IKK、p-IκB蛋白表达水平显著升高,p65蛋白显著降低,而细胞核中p65蛋白表达水平显著升高,同时免疫荧光结果也显示p65蛋白的核移位,说明LaCl₃暴露激活了小胶质细胞内NF-κB信号通路。6、镧暴露对炎症因子表达的影响。体内和体外试验结果显示LaCl₃能显著提高TNFα、IL1β、IL6、MCP1和NO的mRNA转录水平和蛋白表达水平,和对照组相比有显著性差异。7、镧暴露激活BV2细胞对神经元的影响。条件培养液转移和Transwell法建立的共培养模型中,共培养24h后,从0.05mmol/L LaCl₃组开始,神经元开始出现凋亡和坏死等损伤,随着LaCl₃浓度的增加,损伤的程度进一步加重。当共培养48h后,各LaCl₃组神经元的损伤程度和共培养24h时比较都有一定程度的增加。8、PDTC对LaCl₃激活BV2细胞后对神经元损伤作用的影响。体外试验结果发现PDTC预处理细胞能显著抑制BV2细胞内NF-κB信号通路活化水平,降低BV2细胞对TNFα、IL1β、IL6、MCP1和NO的释放和神经元的损伤程度。结论:1、镧暴露可损伤仔鼠的空间学习记忆能力。2、镧暴露可激活小胶质细胞,并活化小胶质细胞内NF-κB信号通路。3、镧暴露可诱导小胶质细胞释放过量的TNFα、IL1β、IL6、MCP1和NO。4、激活的小胶质细胞可以导致神经元发生损伤。5、NF-κB抑制剂PDTC能显著降低小胶质细胞释放炎症因子的水平,拮抗激活的小胶质细胞对神经元的损伤作用。