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α-酮酸具有二羰基结构,是多种生理活性物质的合成中间体,在食品、医药及化工行业应用广泛。生物酶法催化氨基酸制备α-酮酸及其衍生物具有高效、环保和成本低的特点。在催化氨基酸产生α-酮酸的酶类中,膜结合L-氨基酸脱氨酶(mL-AAD)不需要辅酶或氨基受体,不会产生对α-酮酸具有氧化破坏作用的过氧化氢,是制备α-酮酸及其衍生物的较为理想用酶。本文以普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的mL-AAD为研究对象,优化了分泌表达策略和条件。在此基础上,利用表达mL-AAD的重组工程菌进行了苯丙酮酸(PPA)、3,4-二羟基苯丙酮酸(DHPPA)及相应衍生物苯乳酸(PLA)、丹参素(SAA)的生物制备过程研究。主要结果有:1.在pET-28a、pET-20b两个质粒中,分别利用mL-AAD自带的tat信号肽(双精氨酸分泌途径)和pelB(保守分泌途径)-tat整合信号肽介导mL-AAD分泌表达,发现采用自身tat信号肽介导mL-AAD分泌的表达方式.(BL21(DE3)-pET-28a-mlaad)可以获得更优的菌体生长性能和脱氨活力。2.以L-苯丙氨酸(L-Phe)为底物,利用工程菌BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备PPA。在优化条件下(pH = 8.0,温度37 ℃,菌体浓度:0.39 g/L,L-Phe浓度:150mmol/L),反应42h可得到141mmol/LPPA。在此基础上,利用共表达 D-2-羟基异己酸脱氢酶(来自Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)和甲酸脱氢酶(来自Mycobacterium vaccae N10)的工程菌将制备的PPA转化为PLA,在优化条件下,可得到121mmol/LPLA,综合转化率达到80.7%。3.以 L-多巴(L-Dopa)为底物,利用工程菌 BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备DHPPA。在优化条件下(pH = 8.5,温度37 ℃,菌体密度:0.37g/L,L-Dopa浓度:100mmol/L),反应lh可得到28.5mmol/LDHPPA。在此基础上,利用共表达D型乳酸脱氢酶(来自Pediococcus acidilactici DSM 20284)和甲酸脱氢酶(来自M.vaccae N10)的工程菌将制备的DHPPA转化为SAA,在优化条件下,可得到 11.66 mmol/L SAA。