论文部分内容阅读
日本脑炎(Japanese encephalitis,JE)是亚洲地区常见的一种病毒性脑炎,是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一种蚊媒传播的人兽共患传染病,猪是最主要的传染源和扩增宿主。我国是一个养猪大国,JE在猪群中的流行相当普遍,感染后虽不会导致较高的死亡率,但会导致公猪睾丸炎和妊娠母猪流产,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究通过采用RT-PCR、间接免疫荧光和病毒分离等实验室技术对上海市奉贤区某猪场疑似感染JE的病猪样品进行检测,从流产胎儿脑组织中分离到一株JEV,命名SD12株,并对其全基因进行测序分析,构建遗传进化树,鉴定为GⅠ JEV。在此基础上建立了小鼠感染模型,研究其在小鼠体内的动态分布,测定病毒滴度及生物学特性并对其分子进化情况进行了分析。鉴于目前我国GⅠ/Ⅲ JEV共同流行的趋势,为快速、高效检测临床和实验样本中的JEV载量及其基因型,本研究通过对WHV、DENV、ZIKV和GⅠ/Ⅲ JEV毒株序列比对分析,设计特异的探针,建立了区分GⅠ/Ⅲ JEV的Taq Man RT-q PCR方法。经验证该方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,为后续试验研究建立基础。迄今为止没有针对乙脑病毒的特异性抗病毒疗法,疫苗免疫仍是唯一重要且有效的防控措施。我国用于免疫种猪群的JE疫苗是基于SA14-14-2株研发的HW1鼠脑灭活疫苗和细胞培养的SA14-14-2减毒活疫苗,均属于GⅢ乙脑疫苗。SA14-14-2株为20世纪50年代的分离株SA14株的致弱毒株,基因组核苷酸和氨基酸与新流行毒株差异明显,且由于不同毒株的毒力差异较大,亟需评估其对新流行毒株的中和能力。本研究通过SA14-14-2弱毒疫苗株免疫小鼠后,分别感染致死剂量的GⅢ JEV NJ28株和GⅠ JEV SD12株,通过临床症状观察、小鼠发病和死亡情况以及中和抗体水平等评价免疫保护效果。结果表明,免疫两周后经NJ28感染的小鼠生存率为100%,但经SD12株感染的小鼠生存率为90%,相应的产生的中和抗体水平普遍偏较低。基于GⅠ JEV SD12株经BHK-21细胞传代,病毒空斑纯化和动物实验筛选一株弱毒株命名SD-F120株,本研究通过小鼠免疫模型,依据临床症状及小鼠发病和死亡情况以及组织病毒载量评估其对小鼠的安全性,通过检测其对NJ28株和SD12株感染的免疫保护效果,评估其免疫原性。结果表明,SD-F120对小鼠是安全的,免疫两周后能够完全保护被NJ28株和SD12株感染的小鼠,空白对照组和免疫组小鼠生存率均100%,感染对照组小鼠出现典型临床症状及死亡,生存率为0%,表明SD-F120对GⅠ/Ⅲ JEV强毒株都具有良好的免疫原性,为开展猪的免疫保护试验建立了前期数据。通过开展小公猪体内免疫实验,依据临床症状、病毒血症、组织病变及排毒情况等评估其安全性。通过攻毒保护实验,检测猪血清样本的抗体及中和抗体水平,评估SD-F120弱毒株对感染SD12株感染的免疫保护效果。其中感染对照组出现睾丸红肿、神经兴奋等症状,而经SD-F120免疫接种的猪没有出现JE相关临床症状,且产生的病毒血症低,无排毒现象。5.0 Lg PFU的SD-F120单剂次免疫后7天中和抗体可超过保护水平(1:10)达到1:20,14天最高可达到1:113,对照组中和抗体水平小于1:10。表明SD-F120弱毒株对小公猪具有良好的安全性和免疫原性。