论文部分内容阅读
禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)属于冠状病毒科,γ冠状病毒属。其基因组为正单链RNA,5′-端具有帽子结构,3′-端具有多聚腺苷酸尾。IBV-5′端编码ORF1a和ORF1ab,在感染细胞中经翻译合成PP1a和PP1ab两个多聚蛋白,由IBV编码的木瓜样蛋白酶和3CL蛋白酶切割产生15个成熟的非结构蛋白(Nsp2-16),参与病毒的复制,也在病毒-宿主相互作用中发挥重要作用。其中,Nsp16含有赖氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-谷氨酸(KDKE)基序,在冠状病毒中相当保守,具有2′-O-甲基转移酶(2′-O-MTase)活性,与病毒免疫逃逸机制相关,但IBV-nsp16的生物学功能尚未见报道。突变KDKE中的天冬氨酸会导致2′-O-MTase酶活性丧失。本实验室通过突变nsp16中128位的天冬氨酸(D)为丙氨酸(A),利用反向遗传学方法构建并获得了不具有2′-O-MTase活性的突变体r IBV-D128A,发现其致病性比野生型r IBV弱,并通过转录组测序分析发现IBVnsp16能调控细胞基因的表达,但相关数据需实验验证。因此,本研究利用荧光定量RT-PCR和/或Western blot对r IBV-D128A感染A549细胞中与细胞天然免疫相关基因的表达进行了分析,研究结果如下:(1)在A549细胞中,未能检测到RSAD2(radical S-adenosyl methionine domain containing 2)基因,IFITM1(IFN-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)基因在正常和IBV感染A549细胞中的表达量没有显著差异;(2)荧光定量RT-PCR结果显示:在r IBV感染A549细胞中的γ干扰素(IFNγ)、信号传导子及转录激活子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、OASL(2′-5′-oligoadenylate synthetase-like)和细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling,SOCS3)的表达量分别是正常A549细胞中的1.59、1.10、7.04、7.72倍,而在r IBV-D128A感染A549细胞中的IFN-γ、STAT1、OASL和SOCS3的表达量分别是正常A549细胞中的1.02、1.75、2.03、3.17倍。这些结果表明:r IBV感染可上调A549细胞IFN-γ、OASL和SOCS3的表达,r IBV-D128A感染可上调A549细胞STAT1、OASL和SOCS3的表达。但是,r IBV-D128A感染可抑制由r IBV感染诱导的IFN-γ、OASL和SOCS3的上调表达,其表达量分别为r IBV感染细胞中的0.64、0.29、0.41倍,但可增加STAT1的表达,为r IBV感染细胞中的1.59倍;(3)Western blot分析结果显示:r IBV-D128A感染A549细胞中的SOCS3蛋白表达量少于r IBV感染细胞中的SOCS3蛋白表达量,与RT-q PCR实验结果一致,证实r IBV-D128A能减少r IBV感染所诱导的SOCS3上调表达。上述研究结果表明:IBV-nsp16能显著上调A549细胞中的OASL和SOCS3的表达,增加IFN-γ的表达,说明IBV-nsp16具有的2′-O-甲基转移酶参与了与细胞天然免疫相关基因的表达调控。研究结果首次证实了IBV-nsp16能诱导SOCS3的上调表达,为进一步深入研究IBV-nsp16的生物学功能和IBV与宿主相互作用打下了基础。