目的建立食蟹猴精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)分离纯化、体外长期培养及标记分子鉴定、冷冻储存、体外诱导分化的方法体系,为体外研究非人灵长类精子发生机制和食蟹猴SSCs的研究及应用构建转化医学研究平台。方法手术法获取2岁14天的食蟹猴睾丸,采用三步酶消化法分离获得单细胞悬液和差异贴壁法富集SSCs。将细胞培养于经丝裂酶素处理的STO细胞为滋养层,使用添加GDNF, bFGF, GFRα1三个重要生长因子的无血清培养液在体外培养超过20天后,应用CDH1标记分子免疫荧光染色初步鉴定培养的细胞是否为SSCs。长期培养食蟹猴SSCs,将传代至22代的SSCs置于液氮中保存。取冷冻2年后的第22代食蟹猴SSCs进行复苏培养后,以GFRal为主标记分子分别和CDH、Thy-1Oct4、PLZF四个标记分子组合进行细胞免疫荧光双标染色鉴定及RT-PCR验证分析,并利用冰冻切片进行GFRα1免疫荧光染色观察食蟹猴睾丸组织内SSCs的位置分布及形态。将鉴定为SSCs的细胞集落在含有SCF因子的培养基中进行体外诱导分化,并应用精母细胞特异标记分子SCP3进行免疫荧光染色鉴定SSCs是否分化为精母细胞。结果(1)分离纯化的细胞在培养2天后细胞开始形成小集落,5天后细胞集落明显。培养20天后,SSCs呈葡萄串状细胞簇,符合SSCs的形态特征,这些细胞经SSCs标记分子CDH1免疫荧光染色呈阳性表达。(2)体外长期培养并传代至22代的食蟹猴SSCs的免疫荧光双标染色鉴定结果表明GFRα1、CDH1, GFRα1、Thy-1, GFRα1、Oct4, GFRα1、PLZF四组特异标记分子均呈阳性表达。(3) RT-PCR验证分析结果表明GFRα1、CDH1、Thy-1、Oct4在体外长期培养的食蟹猴SSCs中也均呈阳性表达。(4)冰冻切片免疫荧光染色结果显示GFRα1在食蟹猴睾丸中靠近基底膜的单个型、成对型的精原细胞中分布。(5) SSCs体外诱导分化第8天,显微镜下观察到与精母细胞形态特征相似的细胞,食蟹猴SSCs经过体外诱导分化的细胞表达精母细胞特异标记分子SCP3。结论(1)本研究已经成功建立了食蟹猴SSCs的分离纯化、体外长期培养及鉴定、长期冷冻储存、体外诱导分化功能等一整套方法体系。(2) GFRα1、CDH1、 Thy-1、Oct4可用于食蟹猴SSCs的鉴定。(3)食蟹猴睾丸冰冻切片免疫荧光染色显不GFRα1是食蟹猴SSCs的可靠标记分子。(4)本研究体外长期培养的食蟹猴SSCs可成功分化为精母细胞。