荧光探针凭借其技术简单,结构灵活,灵敏度好,无创检测等特点,已成为生物检测的重要工具。然后,细胞环境较为复杂,荧光探针在检测时面临诸多问题。理想的荧光探针应具有高渗透性,无背景干扰,较低的光漂白和光毒性,以助于生物体系内的实时检测和长时间观察而不损害细胞。为了解决这些困扰,双光子荧光探针孕育而生。另外,双光子显微成像技术与双光子探针的完美结合,促进了探针的进步。双光子显微成像技术是将近红外光子作为激发光源,长波低能量的激发光,提高了探针在检测时的稳定性和时空分辨率,降低了光漂白和光毒性,有助于探针在细胞,组织和活体中的应用。近年来,双光子荧光探针已成为生命医学中极其重要的研究工具。亚细胞器线粒体不仅仅为细胞提供源源不断的能量,而且还与细胞分化,增殖,凋亡和信息的传递等有关。细胞内黏度与信号的传导,生物分子的相互作用和代谢物的扩散息息相关,在亚细胞水平亦是如此。线粒体基质黏度的异常变化诱使线粒体网组织的改变,进而影响代谢的扩散,这与许多的疾病和功能障碍有关(糖尿病,阿尔茨海默病,动脉粥样硬化)。细胞内SO2主要通过含硫氨基酸的氧化或亚磺酰丙酮的氧化分解产生,细胞内除了以SO2气态分子的形式纯在外,还以HSO3-/SO32-及其盐的形式存在。SO2可作为气态信号分子介导生理过程,也可以作为抗氧化剂和抗还原剂调节氧化还原平衡。线粒体SO2被认为可显著减轻心肌损伤和异丙肾上腺素诱导的线粒体的肿胀和变形。溶酶体是大多数动/植物细胞中常见的亚细胞器,它包含多种水解酶。溶酶体极性是生物微环境中重要的参数,不仅影响自身的形状,结构和膜透性,而且决定了水解酶的相互作用。溶酶体极性与大分子的分解,水解酶的活性,消化细胞碎片,自噬,清除受损结构有关。另外,溶酶体各区域极性差异明显。在细胞凋亡过程中,溶酶体极性可作为反应因子来观察细胞微环境变化,这对研究细胞生物学和肿瘤病理学具有重要的意义。通过大量的文献阅读和本课题组的工作积累,本文设计合成了两种咔唑为母体的亚细胞器定位的微环境双光子荧光探针,并用精准的化学结构表征手段对中间产物和目标化合物进行结构验证,测试了其光学性能和生物性能并取得了一系列有意义的成果。1.设计合成了双检测线粒体黏度和SO2衍生物的双光子荧光探针MCB。向N-乙基-咔唑母体引入强吸电子基3-甲基苯并噻唑碘鎓盐和弱给电子对甲氧基苯乙炔,整体形成一个强的ICT系统。当MCB为整体时,与N-乙基-咔唑母体双键连接3-甲基苯并噻唑碘鎓盐可做为分子转子检测黏度,其红色荧光发射峰在566 nm处。当SO2衍生物通过迈克尔加成反应与MCB的α,β-不饱和乙烯基-3-甲基苯并噻唑鎓部分反应时,共轭体系被破坏,并且剩余的弱ICT系统导致短波发射,其蓝色荧光发射峰在392 nm处。随着SO2衍生物的滴加,溶液逐渐从黄色变成无色。MCB对SO2衍生物的检测具有较低的检测限(2 nM)和较快的反应时间(～60 s),可以高效灵敏的检测内源SO2衍生物。此外,MCB检测黏度和SO2衍生物的荧光发射不会互相干扰。MCB具有优秀的双光子性能,细胞毒性低,小鼠肝脏切片组织穿透深度达到120 um,细胞成像显示专一定位线粒体。MCB可定量检测溶液和细胞中的黏度,通过荧光寿命成像,定量分析细胞的黏度分布。MCB可以检测溶液和细胞线粒体中内/外源SO2衍生物,可视化检测斑马鱼的黏度和HSO3-。2.设计合成了溶酶体定位的双光子极性荧光探针PCT。通过向咔唑母体引入一个溶酶体靶向定位基团和一个极性响应的基团来设计并合成双光子荧光探针PCT。在PCT探针分子中,碱性四乙烯吡啶基为溶酶体定位组,氮乙基咔唑是双光子荧光团,三苯胺烯酮基为极性响应基团并形成一个良好的D-π-A结构,典型的ICT机理分子构型,是极性分子设计的必要条件,各结构单元相连构成一个大的共轭体系。通过光学测试发现PCT对溶剂的极性变化有良好的荧光响应,可定量检测溶液极性。PCT具有优良的双光子性能,不受温度和pH的影响。在HeLa细胞细胞毒性和共定位试验表明,PCT细胞毒性低和较好的溶酶体定位。另外,通过双光子荧光共聚焦细胞成像,观察细胞凋亡过程中溶酶体极性的变化。