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目的
(1)构建人釉原蛋白(Amelogenin，AMG)成熟肽编码区基因的原核表达载体，建立人AMG成熟肽基因在大肠杆菌中表达和纯化的技术路线。
(2)利用基因芯片，研究猪釉基质蛋白(Emdogmn，EMD)作用下人牙周膜细胞的差异表达基因。
材料与方法
(1)运用TA克隆技术将AMG基因片断插入质粒pMD 18-T，通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，T4 DNA连接酶连接目的基因AMG与原核表达质粒PGEX-4T-1，获得重组原核表达载体pGEX-4T-1/AMG。利用PGEX-4T-1/AMG，转化BL21大肠杆菌，经过对诱导时间，IPTG浓度和诱导温度的优化，进行人AMG成熟肽基因的融合表达。产物过GSTrapFF柱纯化，凝血酶酶切，过HiTrap BenzamidineFF柱去除凝血酶，获得纯化的AMG。
(2)培养第4代牙周膜细胞，实验组加入终浓度为100μg/ml EMD的无血清DMEM培养液，对照组为不含EMD的无血清DMEM培养液，培养3天。提取RNA，cy3和cy5正反标两种方法标记实验组和对照组，用BiostarH-140s基因芯片杂交，检测杂交信号，分析差异表达基因。
结果
(1)对重组质粒pMD 18-T/AMG和pGEX-4T-1/AMG进行酶切和测序鉴定，酶切电泳图和测序结果与预期结果一致。
(2)最佳诱导时间为14.5小时，最佳诱导剂浓度为1.0mM，最佳诱导温度为20℃，在此条件下可溶性目的蛋白的表达量达到峰值。产物过柱纯化后，电泳图谱和western图谱与预期结果一致。
(3)EMD作用于人牙周膜细胞后，表达下调的基因主要有：脂蛋白代谢相关基因；角化细胞生长相关基因；功能尚不清楚的基因。
(4)EMD作用于人牙周膜细胞后，表达上调的基因主要有：抑制炎症相关基因；促进骨生成的基因；促进血管生成的基因；促进细胞和组织生长、增殖、和分化的基因；涉及细胞物质转运的基因；涉及信号传递的基因；功能尚不清楚的基因。
结论
(1)成功构建了人釉原蛋白(AMG)成熟肽编码区基因的原核表达载体。
(2)利用PGEX-4T-1/AMG/BL21原核表达体系成功获得纯化的人AMG蛋白。
(3)EMD作用于人牙周膜细胞后，与细胞的生长、增殖，细胞外基质的合成，新生血管的形成，骨形成等功能相关的基因表达都显著提高，而脂蛋白代谢相关基因和角化细胞生长相关基因的表达下调。