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黄芪甲苷(Astragaloside, AST)是黄芪中重要的药理活性成分,建立该成分的分析方法,有助于研究含黄芪的中药或复方的药理作用机制及体内外代谢规律。目前黄芪甲苷常用的理化分析手段为HPLC等,与传统方法相比,免疫分析法具有前处理简单、灵敏度高、特异性强等独特的优势,这种分析方法的建立有望为黄芪甲苷的研究提供一种新的分析手段。研究目的：1)合成黄芪甲苷的人工抗原,免疫小鼠获得黄芪甲苷的多克隆抗体；制备黄芪甲苷的单克隆抗体,分析其亚型及特异性。2)制备黄芪甲苷的免疫亲和色谱柱,建立免疫亲和层析-高效液相的单克隆抗体鉴定方法。为下一步黄芪甲苷ELISA含量测定方法的建立,以及含黄芪中药或复方的药理药效研究做好铺垫,同时为进行同类化合物及其抗体制备研究提供一种新的思路。研究方法：1)采用经典的过碘酸钠氧化法,合成黄芪甲苷的人工免疫原AST-BSA和包被原AST-OVA,运用紫外扫描法和薄层色谱法对上述偶联产物进行鉴定。2)采用背部皮下多点注射的方式,对6-8周的Balb/C雌性小鼠进行免疫。每只小鼠100μg抗原,与弗氏佐剂等体积充分乳化,每隔14d加强免疫一次,加强免疫3-4次之后,断尾取血,间接ELISA法检测抗血清效价,间接竞争(ic-ELISA法)检验抗血清的特异性,评价人工抗原的免疫原性及免疫效果。3)细胞融合前对Balb/C小鼠进行最后一次腹腔注射冲击免疫,3d后取免疫小鼠的脾细胞制备成免疫细胞悬液,PEG法诱导小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与免疫细胞融合,筛选可以稳定分泌所需抗体的杂交瘤细胞株；有限稀释法单克隆化细胞株,获得单克隆细胞株。体内腹水诱生法大量生产单克隆抗体。4) ic-ELISA法对所获得的单克隆抗体进行特异性分析,考察不同离子强度、pH、添加有机试剂等不同基质条件对单克隆抗体检测的特异性的影响；ELISA法鉴定抗体亚型。5)辛酸法纯化抗体,制备黄芪甲苷的免疫亲和色谱柱,与HPLC联用,通过特异性敲除的方法,鉴定所得的单克隆抗体,并研究其敲除样品指纹图谱及洗脱曲线,建立免疫亲和层析-高效液相鉴定单克隆抗体的方法。结果：1)经紫外扫描和薄层色谱法初步鉴定,黄芪甲苷的人工免疫原AST-BSA和包被原AST-OVA合成成功。2)间接ELISA法及ic-ELISA法的检测抗血清的结果表明,AST-BSA可以刺激Balb/C小鼠免疫产生抗AST的多克隆抗体,抗血清效价在1：32000左右,且与结构类似的化合物交叉反应率都<0.01%；ic-ELISA结果显示,在不同基质条件下,抗血清对AST检测的特异性不同。具体表现为：①0.05 M CBS缓冲液(pH 9.6)条件下,抗血清检测特异性良好,线性检测范围约为1 Ong/ml-10μg/ml。② 0.01 M PBS缓冲液(pH 7.4)条件下,抗血清检测特异性较差,线性检测范围约为1 μg/ml-100 μg/ml。③弱酸性(pH 6.4)条件下,抗血清检测特异性很差。3)经过3次单克隆化筛选出可以稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞株,经鉴定所得的单克隆抗体为IgG2a亚型,并带有κ轻链。4) ic-ELISA法鉴定单克隆抗体的特异性发现,腹水对黄芪水煎液有很强的特异性。不同的基质条件对单克隆抗体检测特异性有不同的影响。具体表现为：①在不同的pH条件下,抗体和包被原的结合能力不同。在碱性(pH=9.4)条件下,抗体和包被原的结合能力较弱,整体OD450nm值较小,竞争抑制率为35.49%；近中性(pH=7.4)条件下,抗体和包被原的结合能力较强,整体OD450nm值较大,但竞争抑制率仅为17.14%。②离子强度对抗体和包被原的结合能力也有影响,本实验尝试了3个离子强度下OD450nm值的变化,发现离子强度为5 mM时,抗体和包被原的结合能力较强,整体OD450nm值较大；离子强度为10 mM次之；离子强度为2.5 mM时,抗体和包被原的结合能力最弱。但三个检测条件下的竞争抑制率均不超过20%。③有机试剂对ic-ELISA检测结果也有较大影响。用正丁醇饱和的水、10%甲醇溶解AST时,竞争抑制率都很低,分别为13.42%和6.07%。④黄芪总皂苷对抗体没有明显的竞争抑制作用,而用它助溶AST时,竞争抑制作用较为明显,线性方程为y=-0.1161n(x)+1.5739,R2=0.9877。5)黄芪提取液、敲除样品及洗脱样品的指纹图谱显示,亲和色谱柱可以将黄芪中的黄芪甲苷特异性敲除；而洗脱曲线的结果也佐证免疫亲和色谱柱对黄芪提取液中成分的敲除具有一定的特异性,提示本实验获得的单克隆抗体即为黄芪甲苷的单克隆抗体。结论：1)薄层色谱法具有操作简单、结果准确等特点,是快速直观鉴定人工抗原是否合成成功的一种较好的方法。2)基质条件对单克隆抗体检测的特异性有较大的影响,建立单抗的免疫分析方法时要选择合适的基质条件。3)免疫亲和层析-高效液相联用的方法可用于鉴定单克隆抗体。本实验获得的黄芪甲苷的单克隆抗体以及制备的黄芪甲苷免疫亲和层析柱可用于中药及复方中有效物质的敲除,以及进行相关活性物质的药理药效研究。