【摘 要】
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本文对蛋白质氨基测定方法三硝基苯磺酸法(TNBS)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行了改进,并用改进后的分析方法对活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰水蛭素(Hirudin)的反应条件进行
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本文对蛋白质氨基测定方法三硝基苯磺酸法(TNBS)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行了改进,并用改进后的分析方法对活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰水蛭素(Hirudin)的反应条件进行了优化,得到了氨基修饰率较高的产物,然后对产物进行了初步分离,并对分离产物的生物活性进行了检测,最后对氧化可溶性淀粉和肝素修饰水蛭素做了一些探索性工作。分析实验结果表明:TNBS反应控制在适当的反应时间内可以得到准确的结果;SDS-PAGE采用BaCl2和I2对mPEG染色比考马斯亮蓝染色水蛭素更为灵敏,特异性也很高。活化mPEG修饰水蛭素的优化反应条件可以确定为:活化mPEG与水蛭素在0.2mol/L,pH8.5缓冲液中,4℃条件下反应10小时,此时水蛭素氨基修饰率为65%左右,平均分子量为17000。mPEG修饰的水蛭素经超滤、Sephadex G50和Superdex75凝胶过滤后可将mPEG-Hirudin和Hirudin分离开,但mPEG-Hirudin仍为混合物,未能逐一分开。氧化多糖修饰水蛭素的结果显示:高碘酸钠氧化多糖修饰水蛭素的方案可行,在pH7.4,0.1mol/L的磷酸缓冲液中氧化得到的淀粉可以与水蛭素偶联。mPEG修饰后的水蛭素生物活性保留率为25.8%,活性损失较严重,可能是因为mPEG与水蛭素的活性位点相结合。
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