裂片石莼多糖的提取分离、结构及抗凝血活性研究

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裂片石莼(Ulva fasiata)属于绿藻门,绿藻纲,石莼科,石莼属,广泛分布于我国沿海,多糖是其主要活性成分。本论文以裂片石莼为研究对象,采用冷水提取和热水提取方法,对裂片石莼中的多糖进行了提取,采用各种色谱分离技术对多糖进行分离纯化,运用化学和现代波谱方法对多糖的结构进行研究,并对多糖的抗凝血活性进行了初步研究。研究结果如下:1.裂片石莼藻体粉末分别经冷水和热水提取得到冷提粗多糖CP和热提粗多糖HP,得率分别为9.2%和28.5%。采用化学方法和高效液相色谱方法对粗多糖CP和HP进行理化性质分析和单糖组成测定,结果表明两者均含有较高的硫酸根,分别为19.8%和21.9%。总糖含量分别为56.6%和58.9%,糖醛酸含量分别为10.8%和11.6%,蛋白质含量分别为12.7%和7.6%。CP和HP的单糖组成都以鼠李糖为主,含有少量葡萄糖和葡萄糖醛酸,微量甘露糖、半乳糖和木糖。2.利用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和Sephacryl S-400凝胶渗透柱层析的方法对粗多糖CP和HP进一步分离纯化,得到七个多糖组分CP1S、CP2S-1、CP2S-2、CP2S-3、CP2S-4、HP1S和HP2S。采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对七种多糖组分进行了纯度分析和分子量测定,结果表明CP1S和CP1S-1纯度较低,而CP2S-2、CP2S-3、CP2S-4、HP1S和HP2S纯度较高,特别是HP1S和HP2S。CP2S-2、CP2S-3、CP2S-4、HP1S和HP2S的分子量分别为100.4kDa,90.3kDa,82.3kDa,871kDa和90.5kDa。理化性质分析表明,这七种多糖硫酸化程度很高,硫酸根含量在24.0~33.5%之间,不含蛋白质。柱前衍生高效液相色谱法(PMP-HPLC)分析表明,HP1S、HP2S主要由鼠李糖组成,含有少量的葡萄糖和葡萄糖醛酸以及微量的半乳糖和木糖。CP1S、CP2S-1、CP2S-2、CP2S-3和CP2S-4主要由鼠李糖组成,含量均高于88.0%。3.采用脱硫酸基反应、甲基化分析、气质联用(GC-MS)和红外光谱(IR)对多糖HP1S和HP2S的结构特征进行研究,并利用核磁共振波谱(NMR)分析方法对多糖HP1S的结构进行了进一步研究。结果表明,多糖HP1S中主要存在三种连接方式,即→3)-α-L-Rhap-(1→、→2,3)-α-L-Rhap-(1→和→2)-α-L-Rhap-(1→,三者的比例为2.11:1.97:1.00。硫酸基团主要位于→3)-α-L-Rhap-(1→的C-2位和→2)-α-L-Rhap-(1→的C-3位。另外,还存在少量的→3,4)-β-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→,硫酸基团可能位于→4)-β-D-Glcp-(1→的C-3位。主要含有→2,3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→、→2)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→、→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→三种结构片段。多糖HP2S以→2)-α-L-Rhap-(1→和→2,3)-α-L-Rhap-(1→为主,其次为→3)-α-L-Rhap-(1→,硫酸基团主要位于→3)-α-L-Rhap-(1→的C-2位和→2)-α-L-Rhap-(1→的C-3位。同样存在少量的→3,4)-β-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→,硫酸基团可能位于→4)-β-D-Glcp-(1→的C-3位。4.通过活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和凝血酶原时间(PT),对粗多糖CP和HP、纯化多糖HP1S和HP2S的抗凝血活性进行了初步研究。结果表明四种多糖均具有良好的抗凝血活性,但较肝素弱;热提粗多糖HP的抗凝血活性比冷提粗多糖CP好,纯化多糖HP1S和HP2S的抗凝活性和粗多糖CP和HP近似。这四种多糖主要通过内源性凝血途径和共同凝血途径发挥抗凝作用,不能抑制外源性凝血途径。本论文成果为裂片石莼多糖的构效关系研究及其综合利用奠定了理论基础,为“海洋糖库”的建设提供了结构新颖的海洋多糖。
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