选题的背景及目的:随着老龄化社会的到来,出现腰腿痛症状的患者逐渐增加,其中腰椎间盘突出是导致腰腿痛的重要原因之一。虽然目前有机械压迫性因素、生物化学活性物质刺激、自身免疫炎症反应等机制学说用于阐明腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation,LDH)腰腿疼痛症状的发病机制,但LDH肢体疼痛症状的具体发生机制仍不明确。交感神经是人体自主神经系统的重要组成部分,大部分交感神经节后纤维为肾上腺素能纤维,以去甲肾上腺素为递质。有研究显示通过采用切断某些特定部位的交感神经纤维可以明显缓解某些神经病理性疼痛,采用对交感神经阻滞的方法也能缓解因周围神经损伤而引起的神经性疼痛症状。交感芽生是一种交感神经节后纤维在周围神经损伤后向DRG内部感觉神经元生长、包绕的现象。大量研究发现背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)内的交感神经芽生现象在神经病理性疼痛中可能发挥着重要作用。在通常情况下,DRG内的交感神经纤维仅分布于DRG内穿行的血管表面,DRG内的感觉神经元对交感神经的兴奋刺激也不敏感。但有学者在周围神经损伤的动物模型中发现交感神经传出纤维会向DRG内延伸生长,广泛包绕感觉神经元,并可形成特殊的“篮状结构”,具有“篮状结构”的感觉神经元除具有较高的自发性放电频率外,引起神经元放电所需的刺激阈值也出现降低。临床上有部分椎间盘突出症患者会出现一些交感性神经异常相关症状,如出现肢体发凉,多汗或无汗等等,然而具体原因却不清楚。大量研究表明DRG交感神经芽生现象同神经病理性疼痛之间有着密切关系。椎间盘突出症患者可以出现严重的神经痛症状,那么椎间盘突出症与DRG交感神经芽生之间是否也存在着联系,交感神经芽生是否也是导致椎间盘突出症疼痛症状的因素之一呢?目前认为椎间盘髓核所引起的免疫炎症反应可能是导致腰椎间盘突出症神经病理性疼痛的重要原因之一,因此本研究旨在初步探寻单纯椎间盘髓核突出与DRG内交感神经的联系,及其对疼痛所产生的作用,以期进一步阐明椎间盘突出症的发病机制,为椎间盘突出症神经病理性疼痛的临床诊治提供新的研究切入点。研究方法:首先,我们通过手术操作制作大鼠腰椎间盘髓核突出疼痛模型,其后观察大鼠行为学改变,并通过检测大鼠后足机械痛阈和热痛阈的方法评估大鼠痛阈变化。然后,我们取出模型大鼠的DRG进行切片和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色,观察DRG内交感神经纤维形态和分布上的变化。最后,我们通过采集DRG切片的IHC染色照片,应用图像分析软件对切片内交感神经纤维数量进行评估测定,并通过统计学方法进行数据分析。一、腰椎间盘髓核突出大鼠模型的制备1.动物分组:本课题采用SD大鼠制作动物模型,大鼠价格低廉,纯合性也相对较好,并且基因也较为接近人类,是目前国际上比较常用的椎间盘突出动物模型。本课题共采用110只雄性SD大鼠,体重约为250-300g。随机抽取其中10只作为空白对照组,另外100只采用数字表法随机分为髓核(nucleus pulposus,NP)处理组(手术组)和非髓核处理组(假手术组),按照术后2、5、7、14、20天五个时间节点,每组每个时间节点10只进行分组。2.制备方法:各组大鼠均用3%浓度的戊巴比妥钠按50mg/kg的剂量进行腹腔内注射麻醉。手术组将大鼠尾部近端切开,暴露尾椎间盘并刺破纤维环使髓核突出,用刮匙取出髓核后缝合创口。于大鼠背侧做正中切口,剥离椎旁肌肉,切除左侧椎板及部分椎间关节暴露L5左侧背根神经节,将自体髓核放置于背根神经节表面后缝合切口。假手术组仅切除L5左侧椎板,并不取出、放置尾部椎间盘髓核。二、大鼠痛阈检测1.大鼠机械性痛阈检测:利用Von Frey纤维丝检测各组大鼠模型各个时间节点后足的机械性痛阈变化情况。2.大鼠热痛阈检测:利用热辐射痛觉测量仪检测各组大鼠模型各个时间节点后足的热痛阈变化情况。三、大鼠DRG内交感神经形态和数量变化1.大鼠灌注固定及标本取材:将正常组、手术组及假手术组大鼠在各时间节点痛阈测试进行完毕后分别进行心室灌注固定处死。用约300ml的4%多聚甲醛行左心室灌注。沿大鼠背侧原纵行切口切开,暴露左侧L5背根神经节并取出。脱水后固定后将背根神经节用冰冻切片机切片,切片厚度约30um。2.切片免疫组化染色染色及观察:DRG切片分别在1:200稀释的TH抗体及生物素化的二抗中孵育,并使用VECTASTAIN®ABC试剂孵育切片。在IHC染色过程中使用Triton-X100以保证更好地促使抗体与抗原相结合。DAB显色,脱水风干,中性树胶封片后放置于光学显微镜下观察。3.交感神经纤维含量测定随机抽取每个DRG切片中的三分之一于显微镜下观察拍照,并通过图像分析软件Image J 1.47v对DRG中的交感神经纤维含量进行测量。通过将图像分析软件测得的交感神经纤维长度总和除以测量面积计算交感神经密度的方法来估测DRG内交感神经纤维含量。四、大鼠DRG内NGF及BDNF含量变化1.大鼠模型制备及分组:雄性健康SD大鼠30只分为手术组(NP处理组)、假手术组(非NP处理组)和正常组。采取随机数字表随机分组的方法对各组大鼠进行随机分组,每个组10只。按照前述方法建立L4及L5双节段NP突出模型。2.DRG样本取材:术后7天,各组大鼠处死。手术取出术侧L4及L5两个节段DRG,装入容器内,标记后-70℃冰箱内保存。3.ELISA测定样本NGF及BDNF含量:采用酶联免疫法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定正常组大鼠、NP处理组大鼠及非NP处理组大鼠DRG内NGF及BDNF含量并统计分析结果。实验结果:一、大鼠模型后足机械性痛阈和热痛阈降低1.手术组及假手术组大鼠术后1周内有明显行为学改变,大鼠出现术侧后足抬高、避免着地负重及舔抚术侧后足现象,NP处理组大鼠表现得更为明显、频繁。术后5天内,NP处理组及假手术组术侧后足机械性痛阈低于正常组大鼠,NP处理组大鼠在术后7、14、20天的机械性痛阈水平低于假手术组和正常组(P<0.05)。2.大鼠术后5天内,NP处理组及假手术组术侧后足的热痛阈值低于正常组大鼠。NP处理组大鼠于术后7、14、20天热痛阈水平明显低于假手术组和正常组(P<0.01)。二、大鼠模型DRG内交感神经向内部生长1.正常组大鼠背根神经节切片经免疫组化染色后,通过在显微镜下观察,仅可见少量棕染的交感神经纤维,且所见交感神经纤维较为细小,并多分布于背根神经节外周部位。2.髓核处理组大鼠背根神经节切片经免疫组化染色后,通过在显微镜下观察,可见棕染的交感神经纤维数量增粗、增多,并向背根神经节内部感觉神经元之间伸入生长,大量感觉神经元被交感神经纤维所包绕。三、大鼠模型DRG内交感神经数量明显增加采集的背根神经节切片照片通过应用Image J图像分析软件进行量化分析后发现,经髓核(NP)移植处理的大鼠背根神经节切片内交感神经纤维数量要显著高于正常组和非NP处理组DRG内所含交感神经纤维数量。四、大鼠DRG内NGF及BDNF含量变化结果显示术后7天,手术组大鼠DRG内NGF含量明显高于正常组和假手术组。术后7天,手术组大鼠DRG内BDNF含量低于正常组和假手术组。结论:一、在单纯自体椎间盘髓核刺激DRG的情况下,可导致大鼠出现痛性行为异常及术侧肢体痛觉过敏现象的发生。二、在单纯自体椎间盘髓核刺激下,大鼠术侧DRG内交感神经可出现广泛性生长,出现“交感芽生”现象。三、NP刺激下DRG交感神经芽生现象可能与NGF表达增高有关,而与DRG内BDNF关联不大。本研究结果提示单纯自体椎间盘髓核刺激可引起DRG内交感神经芽生,从而导致DRG内感觉神经元功能异常。髓核刺激下DRG内NGF含量升高促进交感神经芽生可能是导致椎间盘突出症腰腿痛的重要原因之一。